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1、1IGF1R 的真核表达和单克隆抗体的制 备作者：张翠珍, 余君铭, 周敏, 刘世国, 高慧萍, 田淑君, 李宗海【摘要】 目的: IGF 1R 稳定表达株的建立和抗 IGF 1R 单克隆抗体（mAb）的制备。方法: 从 cDNA 扩增得到人全长 IGF 1R 基因, 构建成含有 E Tag 的质粒。用此质粒建立稳定表达 IGF 1R 的细胞株, 并免疫 BALB/c 小鼠, 经融合、 筛选制备特异性 mAb。结果: 成功构建 IGF 1R 病毒质粒, 并筛选得到稳定表达IGF 1R 的 3T3 细胞, 该细胞免疫 BALB/c 小鼠后筛选得到 6 株稳定分泌抗IGF 1R 抗体的杂交瘤细胞株
2、, Western blot 结果显示抗体 8G3 能特异性识别抗原。结论: 成功制备了 IGF 1R 的 mAb, 为进一步研究 IGF 1R 在肿瘤治疗中的作用提供了有力的工具。 【关键词】 IGF 1R; 真核表达; 杂交瘤; 单克隆抗体胰岛素生长因子 1 受体（insulin growth factor I receptor, IGF 1R）及其配体IGF 在肿瘤发生和转移中的作用研究是近年来的热点。研究发现, IGF 1 通过IGF 1R 的介导, 可以在其他生长因子缺乏的情况下, 促使细胞增殖周期完成1, IGF 1R 在细胞表面的表达量和细胞阻止凋亡的能力成正比2。已经有很多研究
3、表明, IGF 1R 与肿瘤的产生, 发展和转移密切相关3, 4。可见阻止 IGF 1R 的生物学功能, 具有很大的临床应用前景。我们用真核表达的 IGF 1R 作为抗原, 制备了特异性单克隆抗体(mAb), 为研究 IGF 1R 在肿瘤治疗领域的应用提供了有力的工具。1 材料和方法21.1 材料 质粒 pWPXL、 PMD2G、 PAX2 均由瑞士日内瓦大学 T.Didier 博士惠赠、 大肠杆菌 Top10 株, HEK 293T 细胞系、 NIH HeLa 细胞、 NIH 3T3 细胞系以及 Sp2/0 细胞均由本室保存; 限制性内切酶 BamH I、 EcoR I 和 Nde I 均购
4、自大连宝生物公司; 血液采自健康人; 胶回收试剂盒购自华舜生物工程有限公司。HRP 山羊抗小鼠 IgG 是 Sigma 公司产品。抗 E Tag 抗体是 GE Healthcare 产品。BALB/c 小鼠由上海市肿瘤研究所实验动物中心提供。1.2 方法1.2.1 细胞培养和传代 HEK 293T、 NIH HeLa 和 NIH 3T3 细胞系培养条件为: 在 37、 50 mL/L CO2 的培养箱中, 用含有 100 mL/L 胎牛血清（NIH 3T3 用小牛血清）, 100 U/mL 青霉素和链霉素的 DMEM 培养液培养, 并用 2.5 g/L 胰蛋白酶消化传代。取处于对数生长期, 生
5、长状态良好的细胞用于实验。1.2.2 人 cDNA 的制备 取 6 mL 稀释血液（PBS 等比稀释）, 加入 3 mL 淋巴细胞分离液, 400 g, 室温离心 20 min。取单个核细胞, 加入 5 倍 PBS, 400 g, 室温离心 10 min, 重复 1 次, 去上清, 加入 1 mL TRIzol/106 细胞, 室温静置 5 min, 加200 L 氯仿, 剧烈震荡 1 min, 室温静置 5 min, 12 000 g, 4离心 15 min。取上清于另一离心管, 加等体积异丙醇沉淀, -20放置 10 min, 12 000 g, 4离心 15 min, 去上清, 加入 7
6、50 mL/L 乙醇 500 L 洗 1 次, 加适量 DEPC 水溶解, 行RT PCR。反应条件: 70 5 min, 25 5 min, 42 1 h, 70 15 min。1.2.3 引物的设计 从 GenBank 获得人全长 IGF 1R 基因序列, 并据此设计引物。正向引物 P1 为: 5 CGGGATCCATGAAGTCTGGCTCCGGAG 3含 BamH I酶切位点; 逆向引物 P2 为: 5 CGGAATTCGCAGGACGAAGACTGGGG 3含3EcoR I 酶切位点。1.2.4 IGF 1R 基因的扩增、 克隆及测序 以人 cDNA 为模板, P1 和 P2 为引物
7、, 扩增目的基因。PCR 反应条件: 94 4 min, 然后 94 45 s, 57 45 s, 72 4 min, 共 30 个循环, 再于 72延伸 10 min。回收 PCR 产物。空载体 pWPXL 和E Tag（序列为 ggtgcgccggtgccgtatccggatccgctggaaccgcgt）用 EcoR I 和 Nde I 双酶切后连接, 再经双酶切去掉自带的 GFP 片段形成新载体 pWE, 测序确认。用BamH I 和 EcoR I 双酶切 PCR 产物和 pWE, 回收片段, 连接, 转化 Top10 感受态细胞。长出的克隆抽提质粒, 用 BamH I 和 EcoR
8、I 双酶切鉴定, 选取阳性克隆测序。1.2.5 IGF 1R 稳定表达株的建立 采用人 HIV 病毒的缺陷株做为慢病毒载体, 携带目的基因, 感染细胞获得稳定表达株。pWE IGFR、 PMD2G、 PAX2 质粒用磷酸钙法共转染 293T 细胞, 包装产生携带目的基因的病毒颗粒。48 h 后收慢病毒颗粒, 将收取的病毒颗粒感染 NIH3T3 细胞。Western blot 鉴定阳性, 然后采取有限稀释法获得单克隆, 得到 IGF 1R 稳定表达株。1.2.6 小鼠免疫 培养稳定表达 IGF 1R 的 3T3 细胞, 离心后用 PBS（pH7.4）重悬, 每只 BALB/c 小鼠皮下注射 51
9、06 细胞, 连续 3 次, 每次间隔 2 周, 第 4 次免疫后 7 d, 用 ELISA 法检测抗血清效价, 取效价最高的小鼠, 脾内注射 1105 个细胞加强免疫, 3 d 后取小鼠脾脏待用。1.2.7 细胞融合与抗体制备 取脾细胞与骨髓细胞 Sp2/0 融合5。用间接ELISA 法6筛选阳性杂交瘤细胞株。经 3 次有效稀释法克隆化后, 选择 1 株mAb 持续分泌阳性的杂交瘤细胞并扩大培养准备腹腔注射小鼠。接种杂交瘤细胞4前 1 周, 小鼠腹腔注射 500 L 液体石蜡。接种时离心收集杂交瘤细胞 , 用不完全培养液悬浮并混匀, 将细胞数调至 1109/L, 每只小鼠腹腔注射 500 L
10、, 1 周后小鼠腹部明显肿胀, 消毒下腹部皮肤后, 抽取腹水, 所得腹水 3 000 r/min, 收集上清。用硫酸铵法初步纯化腹水, 备用。1.2.8 mAb 的效价和鉴定 效价测定: 采用间接 ELISA 法。用 3T3 细胞种96 孔板, 3104/孔, 并用甲醛固定。 一抗为制备的抗 IGF 1R 的 mAb 8G3, 二抗为 HRP 山羊抗小鼠 IgG, 11 000 稀释, 经 ABTS（2, 2 连氮基 双 (3 乙基苯并二氢噻唑啉 6 磺酸)二铵盐）底物显色后, 于波长 405 nm 测定吸光度(A)值。特异性鉴定: Western blot 法分析, 提取 HeLa 细胞蛋白
11、跑 SDS PAGE 胶, 电转移至硝酸纤维素（NC）膜上, 用 50 g/L 牛奶室温封闭 2 h, 一抗（1500 稀释）, 4孵育过夜。二抗为 HRP 山羊抗小鼠 IgG, 用 50 g/L 牛奶 11 000 稀释, 37, 1 h。用发光液孵育 5 min, 压片观察结果。 2 结果2.1 重组质粒的鉴定 重组表达质粒 pWE IGFR 经 BamH I 和 EcoR I 双酶切后出现 4 113 bp 的目的条带, 符合预期大小, 测序结果显示序列正确, 表明重组质粒构建成功。图 1 IGF 1R 的扩增和阳性克隆鉴定（略）1: /Hind III DNA marker; 2: I
12、GF 1R 的 PCR 产物; 3: 重组质粒 pWE IGFR的酶切分析.2.2 IGF 1R 稳定表达株的鉴定 构建好的 pWE IGFR 质粒在 HEK293T 细胞中包装并收集病毒颗粒, 转染 3T3 细胞, 筛选得到稳定表达 IGF 1R 的细胞株, 5并以抗 E Tag 的抗体作为一抗, 用 Western blot 鉴定, 结果见图 2。图 2 IGF 1R 稳定表达株的 Western blot 鉴定（略）1: pWE 转染 3T3 细胞; 2: pWE IGFR 转染 3T3 细胞.2.3 抗 IGF 1R 蛋白 mAb 的制备和初步鉴定 血清抗体效价最高的免疫小鼠的脾细胞进
13、行融合后, 筛选到 6 株阳性克隆, 分别为 8G3、 6B8、 10G10、 9F3、 3F11、 8B10。取 8G3 细胞株制备腹水来源的 mAb, 以 Western blot 法鉴定, 显示抗体 8G3 的特异性。3 讨论本实验中通过建立稳定表达 IGF 1R 的 3T3 细胞系, 将该细胞系进行免疫小鼠, 通过杂交瘤技术筛选出高效价的 8G3 株 mAb。用 Western blot 鉴定稳定表达IGF 1R 3T3 细胞系, 发现 Mr 在 200 000 有 1 条明显的条带, 据文献7报道, 该条带是 IGF 1R 的前体, 没有经过剪接, 据推测, 可能是受 IGF 1R
14、的过表达或表达载体上 E Tag 标签对其转录后剪接的影响。已有研究表明 HeLa 细胞高表达 IGF 1R8, 因此我们提取 HeLa 细胞蛋白, 采用 Western blot 检测抗体的特异性, 发现在 Mr 130 000 处有 1 条明显的条带, 表明该 mAb 能够与 IGF 1R 胞外区的 亚基发生特异性结合。在 Mr 130 000 条带下方的微弱条带, 应该是IGF 1R 亚基未能完全糖基化的产物9。特异性 IGF 1R mAb 的制备, 为以IGF 1R 为靶向的肿瘤治疗打下基础。【参考文献】1 Russell WE, Van Wyk JJ, Pledger WJ, et
15、al. Inhibition of the mitogenic effect of plasma by a monoclonal antibody to somatomedin CJ. Proc Natl Acad Sci USA, 1984, 81(8): 2389-2393.62 Rubini M, Hongo A, Dambrosio C, et al. The IGF 1 receptor in mitogenesis and transformation of mouse embryo cells: role of receptor numberJ. Exp Cell Res, 19
16、97, 230(2): 284-292.3 Valentinis B, Baserga R. IGF I receptor signaling in transformation and differentiationJ. Mol Pathol, 2001, 54(3): 133-137.4 Hellawell GO, Turner GD, Davies DR, et al. Expression of the type 1 insulin like growth factor receptor is up regulated in primary prostate cancer and commonly persists in metastatic diseaseJ. Cancer Res, 2002, 62(10): 2942-2950.5 余 抒, 罗 萍, 陈洪章, 等. 抗肠出血性大肠杆菌 0157: H7 E
