《IFN-γ对MMP-2、-9和TIMP-1在HL-60细胞中表达的影响》由会员分享，可在线阅读，更多相关《IFN-γ对MMP-2、-9和TIMP-1在HL-60细胞中表达的影响（7页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1IFN- 对 MMP-2、-9 和 TIMP-1 在 HL-60 细胞中表达的影响作者：刘心，王婷，杨华，陈葳，徐波【摘要】 目的 研究白血病细胞株 HL-60 中基质金属蛋白酶 2、9(MMP-2、MMP-9)和基质金属蛋白酶天然抑制剂-1(TIMP-1)的表达及细胞因子干扰素(IFN-)对MMP-2、MMP-9 和 TIMP-1 转录水平的调节。方法 分别在 HL-60 细胞生长的不同时期(1-5d)收集细胞，采用半定量 RT-PCR 方法，分析白血病细胞株 HL-60 中MMP-2、MMP-9 和 TIMP-1 mRNA 的表达水平；以不同浓度的 IFN- 作用于 HL-60 细胞，2
2、4、48 h 后 RT-PCR 检测 MMP-2、MMP-9 和 TIMP-1 mRNA 水平的变化。结果 细胞接种后 24 h MMP-2 和 MMP-9 的 mRNA 水平最高，但 TIMP-1 表达相对恒定。IFN- 各个浓度组对 MMP-2 和 MMP-9 mRNA 表达均有抑制作用(P0.05)，且随着作用浓度的增高 mRNA 表达减少；TIMP-1 对其调节不敏感。结论 明确了白血病 HL-60 细胞株在转录水平表达 MMP-2、MMP-9 和 TIMP-1；IFN- 对 MMP-2、MMP-9 mRNA 表达有明显的抑制作用，而对 TIMP-1 转录无明显作用。 【关键词】 基质
3、金属蛋白酶；基质金属蛋白酶抑制剂；白血病；干扰素-ABSTRACT: Objective To detect the expression of MMP-2, MMP-9 and TIMP-1 in leukemia cell line HL-60, and explore the effect of interferon- (IFN-) on their expression. Methods Reverse transcriptase-polymerase chain reaction was used to assay MMP-2, 9 and TIMP-1 mRNA in leukem
4、ia cell line HL-60 at different time (the first day to the fifth day of the cell growth), and half-quantity values of the influence on the cells after treatment with IFN- in different concentration and different time (24 hours, 48 hours). Results The expression of MMP-2, -9 mRNA was significantly th
5、e highest after 24 hours of the cell culture. But the expression of TIMP-1 mRNA was 2constant. IFN- in different concentration could down-regulate the mRNA expression of MMP-2, -9 (P0.05), and as the concentration increased, mRNA expression decreased. But mRNA expression of TIMP could not be affecte
6、d by IFN-. Conclusion MMP-2, -9 and TIMP-1 mRNA are expressed in leukemia cell line HL-60. IFN- can inhibit expression of MMP-2 or MMP-9, but has no influence on TIMP-1 mRNA expression.KEY WORDS: matrix metalloproteinase (MMP); tissue inhibitor of metalloproteinases; leukemia; interferon-基质金属蛋白酶(mat
7、rix metalloproteinase, MMPs)是一类结构上具有极大同源性、活性依赖于锌离子和钙离子的蛋白水解酶，主要生理功能是降解细胞外基质(extracellular matrix, ECM)成分。对 MMP 在实体瘤中的作用研究表明，MMP 不但介导肿瘤细胞对宿主包括基底膜在内的 ECM 的降解，影响肿瘤的侵袭和转移，还调控肿瘤新生血管的形成，影响细胞黏附分子的功能以及调控肿瘤细胞的生长1-2。白血病的浸润过程是多基因、多步骤、多阶段相互作用的级联反应，其中MMP 介导的 ECM 及基底膜的降解过程是肿瘤侵袭、转移的一个关键步骤。MMP-2 和 MMP-9 是此过程的关键因子。M
8、MP 活性又受到其天然抑制剂的调节3。研究发现，MMP、基质金属蛋白酶抑制剂(tissue inhibitor of matrix metalloproteinase, TIMP)和微环境中的细胞因子三者之间相互调节，构成一个交叉网络而发挥其功能。许多细胞因子对 MMP-2 和 MMP-9 有调节作用。为了进一步了解白血病的浸润和转移机制，寻求白血病治疗的新靶点，我们采用细胞培养和RT-PCR 等方法，观察了 MMP-2、MMP-9 和 TIMP-1 基因在白血病细胞中的表达情况，旨在探讨 MMP-2、9 在白血病发病机制中的作用，以及细胞因子 IFN- 对其表达的影响。1 材料与方法1.1
9、细胞株的培养及分组3急性髓系白血病细胞株 HL-60 由西安交通大学医学院第一附属医院分子中心实验室惠赠。细胞培养液由 RPMI-1640 培养液、100 mL/L 灭活小牛血清及 100 u/mL 的青、链霉素组成。HL-60 细胞置于 37 、50mL/L CO2 饱和湿度的培养箱中悬浮培养，2-3 d 换液一次，实验用细胞处于对数生长期。将 HL-60 细胞以5104 细胞/mL 接种于培养瓶中，分别在细胞生长的不同时期(1-5 d)收集细胞，用于 RT-PCR。IFN- 对 MMP-2、MMP-9 和 TIMP-1 转录水平的调节实验中，将细胞分为空白对照组(不加 IFN-)及 IFN
10、- 10、50、100、200、500 u/mL 组。1.2 药物、试剂及设备IFN- 纯度 99%(晶美生物公司)；RPMI-1640 培养基(GIBCO 公司)；新生牛血清、胎牛血清(民海生物工程有限公司)；DEPC(Sigma 公司)；Trizol Reagent(Invitrogen公司)；反转录试剂盒(Fermentas 公司)；2PCR Taq Mix(广州东盛生物科技有限公司)。CO2 孵箱(National Appliance Company)；GeneAmp PCR System 2400(PERKIN ELMER, USA)；紫外透射反射检测分析仪(上海复生生物工程研究所)
11、。1.3 RT-PCR 法检测 MMP-2、MMP-9 和 TIMP-1 的表达1.3.1 细胞内总 RNA 的提取所用试剂、器具、试管均经去 Rnase 处理，所有实验器具、试管、橡胶和塑料均用 DEPC 浸泡过夜后高压消毒。取各实验组细胞(每组细胞数为 4105)离心弃上清后，加入 TRIZOL 1 mL 反复吹吸至细胞完全溶解，加入氯仿孵育离心后取无色的水相上层，加入异丙醇孵育离心后，取底部胶样团块即为沉淀的 RNA。乙醇洗涤、干燥后，溶解于 DEPC 处理过的三蒸水中，储存于-70 。紫外分光光度仪测4量 RNA 的浓度 A260/280 的比值；10 g/L 琼脂糖凝胶电泳(200
12、V，30 min)，检查18 S 和 28 S 带的存在。1.3.2 cDNA 的制备无核酶的 Eppendorff 管中加入 Oligo(dT)16 1 L 和 RNA 1 g，70 加热后冰上迅速冷却，经短暂离心后，再分别加入 5Reactive Buffer 4 L、10 mmol/L dNTP mixture 1 L、RibolockTM Ribonuclease inhibitor 1 L，70 加热后冰冻、离心，加入 1 L MMLV(逆转录酶，200 单位)，42 孵育 60 min，然后 70 下加热 10 min灭活反应。将转录的 cDNA 储存于-20 ，2 周内进行 PC
13、R 反应。1.3.3 引物设计与合成PCR 引物由引物设计软件 Priemier primer 设计合成，并经由 blast 进行同源性分析(上海 Sangon 公司合成)。MMP-2：上游 5-TGACGGTAAGGACGGACTC-3，下游 5-TGGAAGGGAATGGAAAC-3，扩增片段长度为 324 bp；TIMP-1：上游 5-TTCCACAGGTCCCACAAC-3，下游 5-GCATTCCTCACAGCCAAC-3，扩增片段长度为 165 bp；MMP-9：上游 5-TCCCTGGAGACCTGAGAACC-3，下游 5-CGGCAAGTCTTCCGAGTAGTT-3，扩增片
14、段长度为 308 bp；-actin：上游 5-ACACTGTGCCCATCTACGAGG-3，下游 5-AGGGGCCGGACTCGTCATACT-3，扩增片段长度为 621 bp。1.3.4 PCR 反应2PCR Taq Mix(100 mmol/L KCl、20 mmol/L Tris-HCl、3 mmol/L MgCl2、0.2 g/L 明胶)12.5 L，Primer 1(10 mol/L) 1 L，Primer 2(10 mol/L) 1 L，cDNA 模板1.0 L，ddH2O 加至总体积 25 L。分别按不同条件扩增目的基因片段：MMP-2 循5环参数为 94 30 s，53
15、30 s，72 30 s，共 30 个循环；MMP-9 循环参数为 94 30 s，57 30 s，72 30 s，共 30 个循环；TIMP-1 循环参数为 94 30 s，58 30 s，72 30 s，共 30 个循环；-actin 循环参数为 94 30 s，57 30 s，72 30 s，共 30 个循环。以未经逆转录的总 RNA 作为阴性对照。1.3.5 PCR 产物的检测和分析取 PCR 产物在 20 g/L 的琼脂糖凝胶中电泳，电压恒定为 75 V，电流约为 30 mA。Genesnap 软件对凝胶电泳条带照相，用图像分析仪(Image Master)扫描，Genetools
16、软件行灰度值分析，以目的条带与内参条带的吸光度体积的比值(MMP-2/-actin、MMP-9/-actin、TIMP-1/-actin)代表目的基因 mRNA 的相对水平。1.4 统计学处理实验共重复 3 次，每次各种作用浓度的细胞 3 瓶。实验结果以均数标准差表示，组间比较采用方差分析，两两比较采用 Dunnett-t 检验。以 P0.05 为差异有统计学意义。 2 结果2.1 HL-60 细胞中 MMP-2、MMP-9 和 TIMP-1 mRNA 的表达 HL-60 细胞表达 MMP-2、MMP-9，细胞接种后 24h MMP-2 和 MMP-9 的mRNA 水平最高。HL-60 细胞在第 2 天进入对数生长期，生长状态良好。细胞表达相对恒定的 TIMP-1(图 1)。图 1 MMP-2、-9 和 TIMP-1 在 HL-60 细胞中的表达Fig.1 Expressio
