《CTLA-4基因的多态性与自身免疫性甲状腺病的相关性研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《CTLA-4基因的多态性与自身免疫性甲状腺病的相关性研究（6页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1CTLA-4 基因的多态性与自身免疫性甲状 腺病的相关性研究作者：师志云，杨宝珍，王立斌，吴若芬，康毓芝【摘要】 目的 探讨细胞毒性 T 淋巴细胞相关抗原-4（cytotoxic T lymphocyte associated antigen 4，CTLA-4）基因第一外显子 49 位点 A/G 多态性与自身免疫性甲状腺病（AITDs）的关系。方法 采用聚合酶链反应-限制性片段多态性（PCR-PFLP）技术分析 60 例自身免疫性甲状腺病患者，其中 Graves 病（GD）36 例，桥本甲状腺炎（HT）24 例，87 例健康对照的 CTLA-4 基因第一外显子的 49 位点基因型。结果 GD
2、 组患者 CTLA-4 基因 49 位点 A/G 基因型及等位基因频率与对照组比较，差异有统计学意义（P 0.05）；HT 组与对照组比较，差异无统计学意义（P0.05）；GD、HT 组按性别分层分析后发现 CTLA-4 基因 49 等位基因在不同性别的分布差异均无统计学意义。结论 CTLA-4 基因 49 位点等位基因与 GD 显著相关；GD、HT 患者 49 位点 A/G 等位基因的分布与性别无关。 【关键词】 细胞毒性 T 淋巴细胞相关抗原 4；自身免疫性甲状腺病；基因；多态性Abstract: Objective To investigate the association of ge
3、ne polymorphism of cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4 (CTLA-4) with autoimmune thyroid diseases. Methods The A/G transition polymorphism at position 49 (exon 1, codon 17) of the CTLA-4 gene was determined by polymerase chain reaction restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) metho
4、d in 60 autoimmune thyroid diseases patients which included 36 Graves disease (GD) patients and 24 Hashimotos thyroiditis (HT) patients, as well as 87 control subjects. Results In the exon 1(49) of CTLA-4 gene, the frequencies of genotypes and A/G allele in GD patients was significantly increased co
5、mpared with control subjects (P0.05). When the patients was subgrouped by sex, the frequencies of genotypes were not significant different (P0.05). Conclusion The polymorphism of CTLA-4 gene (exon 1 condon 17 position 49) confers susceptibility to GD. This association is independent of sex.2Key word
6、s: autoimmune thyroid diseases; cytotoxic T lymphocyte associated antigen 4; gene；polymorphism自身免疫性甲状腺疾病（autoimmune thyroid disease，AITDs）主要包括 Graves病（Gravesdisease, GD）和桥本氏甲状腺炎（Hashimotos thyroiditis, HT），是一组T 淋巴细胞介导的器官特异性自身免疫性疾病。AITDs 是一种多发病，其发病率在 1%2%，可影响全身多个系统且治疗难度大，其发生是遗传和环境因素相互作用的结果。虽然 GD 和 HT
7、 临床表现不同，但都发生体液或细胞免疫介导的甲状腺上皮细胞破坏。CTLA-4 基因（位于 2q 33）是其易感基因中的一个1-2。最近有研究表明：AITDs 与 CTLA-4 基因第一外显子 49 位点 A/G 多态性有关，但各家报道不尽相同，说明不同人种的易感基因及其对疾病的作用存在一定差异。本文通过对 CTLA-4 基因第一外显子 49 位点 A/G 多态性研究，探讨 CTLA-4 基因第一外显子 49 位点 A/G 多态性与 AITDs 的相关性。1 材料与方法1.1 研究对象63 例（回族 2 例）AITDs 患者均为宁夏医科大学附属医院内分泌科住院部病人，男 21 例，女 42 例，
8、平均年龄（44.4711.81）岁，其中 GD 患者 45 例（男 16 例，女29 例），HT 患者 18 例（男 5 例，女 13 例）。诊断均根据临床症状、体征及甲状腺功能检测确诊，临床有甲亢表现排除 1 型糖尿病、系统性红斑狼疮等自身免疫性疾病。87 例（回族 23 例）正常对照男 15 例，女 72 例，平均年龄（38.9311.70）岁，来自我院门诊体检人员，均无甲状腺疾病及其它自身免疫性疾病的家族史。1.2 主要试剂与仪器3Bbv 限制性内切酶由纽英伦生物技术（北京）有限公司提供，Taq DNA 聚合酶由中国大连 TaKaRa 公司提供；MasterCycler PCR 扩增仪（
9、Eppendorf，德国），Gel Doc2000 凝胶图像分析系统（BIO-RAD，美国）。1.3 实验方法1.3.1 提取外周血白细胞基因组 DNA取外周血 5mL（EDTA-2Na 抗凝），低温冷冻溶解红细胞后，用全血基因组DNA 提取试剂盒提取外周血白细胞基因组 DNA。Nanodrop 核酸蛋白测定仪测定DNA 的浓度及纯度，-20储存备用。1.3.2 PCR 扩增 CTLA-4 基因外显子 1以基因组 DNA 为模板，用 PCR 扩增 CTLA-4 基因外显子 1（包含第 49 位多态性位点）。引物序列：上游引物为 5-GCTCTACTTCCTGAAGACCT-3，下游引物为 5-
10、AGTCTCACTCACCTTTGCAG-3，引物由上海生工合成。PCR 反应体系25L：基因组 DNA 100 ng，灭菌去离子水 10L，10buffer 5L，2mmolL1 dNTPs 4L，20molL1 引物各 0.5L，Taq 酶（5UL1）。94预变性5min；94变性 30s，53退火 30s，72延伸 40s，共 30 个循环；72延伸 5min，最后 4保存。1.3.3 CTLA-4 基因外显子 49 位点 A/G 多态性分析用限制性内切酶 Bbv 对 PCR 扩增产物进行酶切：PCR 扩增产物 8.0L，去离子水 4.5L，10buffer 1.5L，Bbv 2U，总体
11、积 15.0L。37酶切过夜。酶切产物4用 12%非变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，EB 染色进行基因型鉴定。1.4 统计学方法研究样本的群体代表性用 Hardy-Weinberg 平衡检验确认，计量资料以均数标准差表示，组间基因型频率、等位基因频率的比较用 2 检验，数据处理采用SPSS 11.0 软件。2 结果2.1 CTLA-4 基因第一外显子 49 位点基因型含 49A/G 位点的 PCR 扩增产物作 6%聚丙烯酰胺凝胶电泳，扩增片段长度为162bp，49 位点基因型为 G/G 时，162bp 的 PCR 产物被消化为 88bp 和 74bp 2 个片段；基因型为 A/A 时则不能被酶切，
12、电泳后只有 1 条 162bp 片段；基因型为 A/G型时，则有 3 条片段，分别是 74bp、88bp 和 162bp，见图 1。2.2 CTLA-4 基因 49 位点 A/G 基因型及等位基因频率经 Hardy-Weinberg 平衡法检验各组基因频率，等位基因的分布具群体代表性（AITDs 组 2=1.24，P=0.538；对照组 2=5.78，P=0.06）。结果显示，GD 组 CTLA-4基因 49 位点 A/G 基因型及等位基因频率与对照组比较，差异有统计学意义（P0.05）；HT 组与对照组比较，差异无统计学意义（P0.05），见表 1、2。表 1 AITDs 组与正常对照组 C
13、TLA-4 基因 49 位点 A/G 基因型的比较（略）表 2 AITDs组与正常对照组 CTLA-4 基因 49 位点 A/G 等位基因频率的比较（略） 2.3 不同性别 AITDs 患者 CTLA-4 基因型5不同性别 CTLA-4 基因 49 位点 A/G 基因型、等位基因频率，2 检验结果显示P 值均大于 0.05，无统计学意义，结果见表 3。表 3 AITDs 按性别分组后 CTLA-4基因第一外显子 49 位点 A/G 基因型及等位基因频率（略）3 讨论CTLA-4 属于细胞表面共刺激分子,与 CD28 属于同一家族,都是调节 B7 细胞表面分子,与 B7 分子结合可抑制 T 细胞
14、增殖、活化，诱导 T 细胞耐受,维持机体细胞/体液免疫平衡。它表达于 CD4+、CD25+调节性 T 细胞表面,在自身免疫炎症状态下,磷酸化的 CTLA-4 可以降低 T 细胞受体信号转导,控制自身反应性 T 细胞,抑制 T 细胞的活化及克隆4。人类 CTLA-4 基因定位于 2q 33，在基因组中仅有一个拷贝。CTLA-4 基因有 3 个多态性位点：启动子 318 位点 C/T 多态性；外显子 1第 17 密码子 49 位点 A/G 多态性，外显子 4 的 3非翻译区 642 位点的二核苷酸（AT）n 可变重复序列。体外功能研究显示，外显子 1 的 A49G 位点和启动子区 C-318T 位
15、点能显著影响 CTLA-4 基因的转录活性和 mRNA 的表达水平5-6，导致个体自身免疫疾病的易患倾向不同。AITDs 是由 T 细胞介导的自身免疫过程，发病受多种易感基因和环境因素控制。许多研究均证明，CTLA-4 基因存在多态性，与 AITDs 等自身免疫性疾病密切相关，国内外有 GD 病与 CTLA-4 基因多态性之间关系研究的报道，但所显示的结果并不完全一致。Yanagawa 等7报道美国白种 GD 病人与 CTLA-4 多态性有较少的相关性，而在意大利、日本、韩国人群中启动子多态性与 AITD 显著相关8-10。国内文献报道中，吕玲11等研究发现 GD 发病与 CTLA-4 第 3
16、 外显子的 3非翻译区二核苷酸(AT)重复序列 106bp 和 CTLA-4 外显子 1(49)A/G 等位基因多6态性相关,但与 CTLA-4(318)C/T 多态性有较少的相关性。王巧宏12，周文旭13，张勤14等也均支持 49 位点 A/G 等位基因是 AITD 的危险因素之一。本研究采用 PCR-RFLP 技术，对 CTLA-4 基因第 1 外显子 49 位点基因多态性与AITDs 的相关性进行分析，结果发现 GD 组外显子 49 位点基因型频率、等位基因频率与对照组相比差异有统计学意义，这与国内大部分研究结果一致。由于 GD 发病女性明显高于男性，Donner 等15研究结果认为 GD 患者与正常对照的等位基因携带水平有着明显的性别差异（P0.05）；我国青岛的研究也进行了性别的比较16，未发现统计学意义。我们在 AITDs 患者中，比较不同性别CTLA-4 基因位点基因型、等位基因频率,经
