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1、1Klotho 基因及其多态性的研究进展【关键词】 klotho 基因； 多态性； 研究进展Klotho 基因是 Kuro 等1于 1997 年发现的与衰老有关的新基因，并用古希腊神话中纺织生命之线女神的名字命名。Klotho 基因被敲除的小鼠(KL-/ 小鼠)可出现类似人类衰老的各种表型，如寿命缩短、不育症、动脉硬化、皮肤萎缩、骨质疏松、肺气肿等。近年来对 klotho 基因多态性与疾病的关系逐渐受到重视，现将有关研究现状综述如下。1 Klotho 基因的结构Klotho 基因长 50 kb，由 5 个外显子和 4 个内含子组成2，3。人的 klotho 基因位于 13q12，klotho
2、基因的操纵子内没有 TATA 盒和 CAAT 盒，但有 5 个潜在的SP1 结合位点，外显子 1 及旁侧 2 000 bp 序列中，G+C 的平均含量为 66.75%，最高达到 98%，提示在这一区域有 CpG 岛的存在1，4。在 klotho 基因结构中，其RNA 存在着一个潜在的可变剪切位点，这一位点如果接受了一个 50 bp 片段的插入，该插入序列末尾的两个核苷酸 TA 就会与外显子 4 的第一个核苷酸 G 共同构成一个终止密码 TAG，使得 RNA 由此截断形成一个短的开放阅读框，仅含 3 个外显子和 2 个内含子而编码分泌型 klotho 蛋白。但如果可变剪切位点没有 50 bp片段
3、的插入，其 RNA 就是一个完整的结构，包括 5 个外显子和 4 个内含子，编码形成一种膜型 klotho 蛋白。人的膜型 klotho cDNA 全长 3 036 bp，分泌型 cDNA全长 1 647 bp。膜型 klotho 基因表达的膜型蛋白是一种单跨膜蛋白，包括一个 N端信号序列、带有两个内部重复片段的 KL和 KL细胞外区域，一个单跨膜区和2一个短的胞内区。在 KL和 KL之间有一段 Lys Lys Arg Lys 的碱性氨基酸序列，可能为蛋白酶裂解位点，该位点有时可能被裂解，释放出小肽而作为体液因子发挥作用。而分泌型 klotho 基因表达的分泌型蛋白由于可变剪切的原因，仅含有
4、N 端序列和 KL胞外区，缺少了 KL胞外区、跨膜区和胞内区。人的膜型蛋白 含有 1 012 个氨基酸，分泌型蛋白含有 549 个氨基酸。2 Klotho 基因多态性Klotho 基因共含有 400 多个单核苷酸多态性(SNPs)，其中影响转录和蛋白表达的主要是启动子区和外显子区的 SNPs，其中启动子区有 16 个 SNPs，5 个外显子区共有 15 个 SNPs，其余均在内含子内。目前研究最多的是 KL VS5，包含 6个 SNPs，位于外显子 2 区附近，3 个 SNPs 在外显子 2 区内，其中 1 个为无义突变，另两个 F352V（A1056G） 和 C370S（G1110C），这
5、6 个 SNPs 处于完全连锁不平衡。KL VS 具有明显的种族特异性，白种人群有 20%31%的变异5，6，而日本和韩国等亚洲人群未发现变异7，8。其他如启动子 395 也存在 G A 变异，在正常人群中 G、A 的频率分别为 80.4%85.7%和 14.3%19.6% 7，9，10。该等位基因是 Kawano 等8在研究绝经后妇女骨密度时发现，电泳迁移率变动分析(EMSA)显示 GA 替换后 DNA 蛋白复合物的量明显下降，推测该替换可能通过减少蛋白和 klotho 基因启动子区结合而改变 klotho 基因表达。外显子 4 区的C1818T（HisHis）的变异，并不能引起氨基酸表达的
6、改变，但可能也与某些疾病有关，多项研究表明11，12外显子区的无义突变也可能产生有异常功能的多种转录或影响产物的表达水平，Kawano 等8用 RT PCR 方法没有发现 C1818T 变异引起的 klotho 基因转录的变化，推测 C1818T 位点可能与影响 klotho 基因功能的一个 SNP 位点有机联系在一起。在正常人群中 C、T 的频率分别为58.9%81.9%和 18.1%41.1%7，10。klotho 基因其他 SNPs 如启动子区3G 959C 、外显子 1 区 A44C 和 C234G、外显子 4 区 C2298T 等，因未发现与疾病有关或小等位基因频率低于 5%，在此不
7、再赘述。3 Klotho 基因多态性与疾病易感性的关系3.1 Klotho 基因与心血管疾病Klotho 基因缺陷的小鼠在出生 4 w 后即可出现动脉硬化，并随着年龄的增加而加重，这些血管变化与人类动脉硬化非常相似。把外源性正常 klotho cDNA 转导给 klotho 基因缺陷的小鼠后，其动脉硬化程度可得到显著改善1，由此推测在人体也可能存在 klotho 基因突变或有特定的 klotho 等位基因与动脉硬化密切相关。为此，Arking 等13检测了两组相互独立的无症状冠心病患者的 KL VS 等位基因频率，同时比较冠心病的危险因素如血糖、血脂、血压、体重指数、吸烟情况，经过 Logis
8、tic 回归分析，证实 KL VS 等位基因是早发冠心病的独立危险因素。随后他们14又检测了 525 例北欧犹太教徒的 KL VS 等位基因频率，并用多元回归法分析 KL VS 基因型与血压、血脂等心血管危险因素的关系，发现HDL C 和收缩压与 KL VS 具有相关性，野生型（FF）和 KL VS 纯合型（VV）与杂合型（FV）相比，HDL C 分别下降了 3.47 和 9.80 mg/dl，收缩压升高 6.51 和 18.97 mmHg，提示 KL VS 纯合型患心血管疾病的危险度最高。用 Cox 回归分析，KL VS 纯合型和野生型较杂合型相对危险度提高了 4.49 和 2.15 倍。以
9、上报道均提示 KL VS 基因与心血管疾病密切相关。除 KL VS 基因外,在亚洲地区也进行了启动子区 G 395A 与心血管疾病关系的研究其关系目前尚不明确。Imamura 等9认为冠状动脉狭窄患者 klotho 基因 395A 等位基因频率(29.9%)明显高于对照组(19%)，调整后的 P=0.029，而冠状动脉痉挛组(23.4%)与对照组无显著性差异，4从而推测 395A 可能是冠心病独立的基因危险因子。而 Rhee 等15在对 274 例因胸痛进行冠状动脉造影检查的韩国人 G 395A 分型中发现，冠心病患者携带A 等位基因(GA+AA)的频率(45.1%)与非冠心病患者(54.9%
10、)相比，两者无显著差异(P=0.746)，目前 395A 等位基因是否是冠心病筛选基因还有待大样本进一步证实。3.2 Klotho 基因与骨质疏松人的骨质密度是基因和环境共同作用的结果，实际上 Ralston 等16认为基因在骨质密度方面可能起到 50%80%的作用，而且不同基因在不同年龄阶段起着不同作用。由于 KL-/-小鼠可出现类似人类衰老的各种表型，包括骨质疏松，由此推测 klotho 基因多态可能与骨质疏松有关。Kawano 等8研究报道在 55 例65 岁绝经期妇女的小样中提示 klotho 基因可能与衰老有关的骨质疏松有关。Mullin 等17报道与此相反，他们检测 1 190 例
11、白种人绝经期妇女基因型及其各部位（包括髋骨、股骨颈、股骨粗隆和粗隆间）的 BMD 和其中 200 例降钙素，发现 G 395A和 C1818T 两基因多态与各部位的 BMD 无关,而 C1818T 多态与血清降钙素有关,TT 型的降钙素明显大于 CT 型,CT 型大于 TT 型。以上报道存在矛盾之处，提示G 395A 和 C1818T 多态与人体骨质密度(BMD)可能无关，还有待进一步研究。在 T352V 与 BMD 的关系方面，Zarrabeitia 等18检测 362 位西班牙男性的F352V 基因型和各部位(包括腰椎、股骨颈、髋骨和跟骨)的 BMD，362 位男性作为整体，FV+VV 基
12、因型的 BMD 与 FF 的无明显区别，53 岁的中青年人群中，FV+VV 基因型的 BMD 明显高于 FF 基因型的。Riancho 等10则认为女性的F352V 基因型和 BMD 的关系与绝经状态有关，绝经前 F352V 基因型和 BMD 无5关，绝经后含 FV+VV 基因型的妇女 BMD 较含 FF 基因型的高。由此推测 F352V多态与 BMD 可能有一定的关系。FF 基因型可能是骨质疏松的危险因素。3.3 Klotho 基因与糖代谢由于 KL-/ 小鼠血糖和胰岛素水平下降且胰岛素敏感性增加，相反，klotho 过表达的小鼠胰岛素抵抗，推测 klotho 基因可能与糖尿病有关。Rhee
13、 等19检测251 例健康韩国妇女快速血糖和胰岛素抵抗指数（HOMA IR）并用 RT PCR 检测 klotho 基因型，发现 G 395A 与血糖无关，而 C1818T 与血糖有关，含 T 等位基因血糖高于 C 等位基因，HOMA IR 平均值也明显增高，提示 klotho 基因可能是研究糖代谢的候选基因之一。Graham 等20在对 1 793 例无糖尿病家族史的 2型糖尿病患者、1 619 例正常对照和来自 509 例 2 型糖尿病家庭的 1 616 例个体进行 klotho 基因 F352V 检测，证明糖尿病患者 FV+VV 基因型（28%）与正常对照（28%）无显著差异，用 FBA
14、T 软件进行家系关联性分析，发现 V 等位基因与糖尿病并无明显关联，提示在大型病例 对照研究和家系研究中并未发现 klotho 基因F352V 与 2 型糖尿病有关。3.4 Klotho 基因与肿瘤Klotho 的功能目前研究较多的是：klotho 蛋白抑制氧化应激、提高哺乳动物细胞对氧化应激的抵抗能力21；抑制参与肿瘤发生发展的 IGF 1R 的作用2225；klotho 基因缺乏的小鼠具有免疫抑制作用1，26。以上均提示 klotho可能是一个肿瘤抑制因子27。Wolf 等28在研究 klotho 蛋白的表达与肺癌的关系时发现 klotho 表达在正常肺组织较肺癌组织高,在癌组织中,癌块较
15、小的肺癌组织 klotho 表达较较大的肺癌组织高,Wolf 等的结论证实 klotho 可能是一个肿瘤抑6制因子。然而 Lingeng 等29在研究卵巢癌与 klotho 蛋白表达的关系时发现卵巢上皮细胞癌组织 klotho 蛋白表达较正常组织增高，klotho 表达可能与卵巢癌的进展有关,这一结论与 Wolf 等结果相矛盾。klotho 蛋白与肿瘤的关系还待进一步研究。我们30在研究 klotho 基因多态与胃癌的关系时发现胃癌患者 395A 明显高于正常对照，这是首次关于 klotho 基因多态与肿瘤关系的研究。4 展 望Klotho 是与衰老有关的新基因，目前其多态性与疾病易感性的研究
16、主要集中在心血管、骨质疏松和糖代谢方面的研究，而与肿瘤和免疫功能关系的研究较少。有关 klotho 基因多态性与疾病的关系研究也应考虑这些方面。klotho 基因功能与各种老年性疾病关系的研究帮助我们阐明衰老的分子机制及内在本质，为更好防治衰老性疾病、延长人类寿命奠定基础。 【参考文献】1 Kuro o M，Matsumura Y，Aizawa H,et al.Mutation of the mouse klotho gene leads to a syndrome resembling agingJ.Nature,1997；390:45 51.2 Matsumura Y，Aizawa H，Shiraki Iida T,et al.Identification of the human klotho gene and its two transcripts encoding membrane and secreted k
