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1、1IL1、幽门螺杆菌 cagA 与人慢性胃 炎的关系作者：乔文，李娜，李长顺，薛挥【摘要】 目的 探讨 IL 1、幽门螺杆菌 cagA 基因(cytotoxin A)和人慢性胃炎之间的相关性。方法 收集西安交通大学医学院第一附属医院胃镜检查的胃活检标本，经甲醛固定，制备石蜡切片，进行病理分型和 IL 1 SABC 免疫组化染色;同时作幽门螺杆菌培养，16s rRNA PCR 鉴定，检测 cagA 基因。结果 慢性萎缩性胃炎组IL 1 表达的阳性率高于慢性浅表性胃炎组(P0.05);慢性萎缩性胃炎组中，异型增生组 IL 1 表达的阳性率高于肠腺化生组(P0.05)。幽门螺杆菌 cagA 基因阳性
2、率在慢性萎缩性胃炎组和慢性浅表性胃炎组无显著性差异(P0.05)，异型增生组 cagA 基因阳性率和肠腺化生组亦无显著性差异(P0.05)。结论 IL 1 在慢性胃炎的转归和发展中具有比 cagA 基因更高的预测价值。 【关键词】 IL 1;幽门螺杆菌;cagA 基因;慢性胃炎ABSTRACT: Objective To discuss the correlation between IL 1, cagA of Helicobacter Pylori and chronic gastritis. Methods We collected the gastric biopsy specimens
3、 by gastroscopy for pathologic examination and culture of Helicobacter pylori. In the meantime, IL 1 was detected by SABC histoimmunology and cagA gene was tested by polymerase chain reaction. Results The positive rate of IL 1 in chronic atrophic gastritis group was higher than that in chronic super
4、ficial gastritis group (P0.05). In the chronic atrophic gastritis group, the positive rate of IL 1 in dysplasia group was higher than that in intestinal mesplasia group (P0.05). There was no obvious difference in the positive rate of cagA gene between chronic atrophic gastritis group and chronic sup
5、erficial gastritis (P0.05). There was no obvious difference in the positive rate of IL 1 between dysplasia group and intestinal mesplasia group (P0.05). Conclusion IL 1 has a higher value than cagA gene in predicting the prognosis of chronic gastritis.2KEY WORDS: interleukin 1; Helicobacter pylori;
6、cagA; chronic gastritis幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, Hp)是一种革兰氏阴性染色菌，寄居于人的胃黏膜中。在环境因素中，Hp 感染是引起胃炎、消化性溃疡和胃癌的主要因素1。目前世界上有半数以上的人被 Hp 感染，但其中大多数为无症状感染者，只有极少数发展成胃癌，因此目前认为可能既存在 Hp 感染的因素，也有宿主本身的因素。在 Hp 致病机制中2，其分泌的毒力因子细胞毒素相关基因(cytotoxin associated gene A, cagA)所编码的 cagA 毒素是 Hp 重要的毒力因子之一，cagA 蛋白的表达有赖于 cagA 基因的存在。I
7、L 1 可抑制胃酸分泌，持续的低酸分泌可发展成为胃萎缩，增加了宿主胃癌发生的危险性3。本研究旨在探讨宿主 IL 1、幽门螺杆菌 cagA 基因和慢性胃炎之间的相互关系。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 标本来源 200 例胃黏膜标本均取自西安交通大学医学院第一附属医院胃镜室接受胃镜检查的患者。取材部位距幽门口 35cm 处的胃窦小弯侧黏膜 4块，分别送病理制备石蜡切片和置于 0.5mL 布氏培养液中用于细菌分离培养。排除标准：有外科手术史;感染 HBsAg、HIV 病毒;有活动性胃肠出血;在接受胃镜检查前 1 月内服用激素或其他免疫抑制剂、抗体及质子泵抑制剂。经病理证实为慢性浅表性胃炎 6
8、4 例，慢性萎缩性胃炎 136 例，其中肠上皮化生 75 例、异型增生61 例。1.1.2 主要实验材料 哥伦比亚琼脂培养基和布氏肉汤粉购自上海卫生防疫站。Hp cagA 和 16s rRNA primer 由上海生物工程技术公司合成，primer 序列见cagA。primer1：5 ATAATGCTAAATTAGACAACT 3TGAGCGA 3，primer 2：5 TTAGAATAATCAACA AACATCACGCCAT 3;16s rRNA：primer 1：5 TGG CAATCAGCGTCAGGTAATG 3，primer 2：5 GCT AAGAGATCAGCCTATGTCC
9、3。白介素 1 多克隆抗体由 Santa Cruz Biotechnology 公司提供。SABC 免疫组化试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司。Taq DNA 聚合酶购自西安鼎国有限公司。标准菌株 8823、60190 由英国ATHERTON JC 博士惠赠。1.2 方法1.2.1 幽门螺杆菌的培养及鉴定 将所取组织在含有 4mL 生理盐水的无菌匀浆器中研磨成匀浆，分别吸取 0.5mL 接种于哥伦比亚琼脂培养基，然后用接种环将其均匀划开，放入厌氧培养箱中，抽气 换气 1 次。在微需氧条件下，37培养5d。取 1 接种环幽门螺杆菌 ，生理盐水稀释后，涂于载玻片上，常规 Gram 染色，完成初步
10、鉴定。1.2.2 模板 DNA 的制备 刮去培养基平板上的可疑菌落，将其溶于 500L 生理盐水中，-30冷冻 20min，取出置于室温 15min，完全溶解，混匀后，再放入冰箱。如此反复冻融 3 次后，4 12000r/min 离心 15min，吸取上清液，-20保存备用。1.2.3 16srRNA 基因 PCR PCR 反应总体积 25L。PCR 反应体系包括：10PCR缓冲液 2.5L，4dNTP(250mol/L)2.5L，primer1(25mol/L)0.75L，primer2(25mol/L)0.75L，模板 3L，Taq DNA 聚合酶(5u/mL)0.5L，去离子水 12L，
11、MgCl2 3L。反应条件：95 变性 5min(94 1min，55 41min，72 1min)30 个循环72 7min4保存。15g/L 琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR 产物。1.2.4 cagA 基因 PCR PCR 反应总体积 25L。PCR 反应体系包括：10PCR 缓冲液 2.5L，4dNTP(250mol/L) 0.5L，primer 1(25mol/L)0.75L，primer 2(25mol/L)0.75L，模板 5L，Taq DNA 聚合酶(5u/mL)0.5L，去离子水 15L。反应条件：94 变性 5min(94 30s，55 30s，72 1.5min)30 个循环72
12、 5min4保存。20g/L 琼脂糖凝胶电泳鉴定 PCR 产物。 1.2.5 胃黏膜的组织病理学诊断 两位病理医师盲法阅片。常规 HE 染色法，根据国际胃肠病的病理学诊断标准确定胃黏膜活检标本的病理分型。1.2.6 IL 1 免疫组织化学染色 对幽门螺杆菌培养阳性者的组织切片进行免疫组化染色。常规脱蜡至水，每张切片加 10g/L Triton X 100 工作液 50L、37 1h 进行抗原修复。加 50g/L BSA 封闭液，室温 20min。加 130 稀释的一抗兔IgG，4过夜，PBS 洗涤 2min3 次。加生物素化羊抗小兔 IgG，37 1h，PBS 洗涤 2min3 次。加 SAB
13、C 37 40min，PBS 洗涤 5min4 次。DAB 显色。苏木素复染，脱水、透明、封片和显微镜下观察。1.2.7 统计学分析 采用 SPSS10.0 统计学软件。cagA 基因与慢性萎缩性胃炎、肠上皮化生、不典型性增生与慢性浅表性胃炎的关系采用 2 检验;IL 1 免疫组织化学染色与慢性萎缩性胃炎、肠上皮化生、不典型性增生与慢性浅表性胃炎的关系采用 2 检验，肠上皮化生和不典型性增生的关系采用 2 检验。P0.05 为差异有统计学意义。2 结 果52.1 幽门螺杆菌的培养和鉴定 幽门螺杆菌呈透明、针尖样大小状。Hp 涂片Gram 染色镜检呈弧形、S 形、海鸥状弯曲菌或短杆菌。16srR
14、NA 基因 PCR 产物为一条 522bp 的清晰电泳条带(图 1)。200 例标本中幽门螺杆菌菌株分离数为：慢性浅表性胃炎 32 例，慢性萎缩性胃炎 85 例，其中肠上皮化生 47 例，非典型增生 38例，合计分离菌株数 117 例。2.2 cagA 基因 PCR 分析 117 株临床分离的 Hp 中 93 株为 cagA 基因阳性(图 2)，阳性率 79.5%。其中 25 例慢性浅表性胃炎，68 例慢性萎缩性胃炎，其中肠上皮化生 37 例、异型增生 31 例(表 1)。经 2 检验，慢性萎缩性胃炎组与慢性浅表性胃炎组比较，P=0.19;肠腺化生组与慢性浅表性胃炎组比较，P=0.22;异型增
15、生组与慢性浅表性胃炎组比较，P=0.22，均无显著性差异。2.3 IL 1 免疫组织化学染色 IL 1 蛋白主要定位于胃黏膜细胞质中，呈棕黄色颗粒(图 3)。随机计数 5 个高倍视野，计算阳性细胞百分率，30%为阳性，30%为阴性。染色强度判定：浅黄色为弱阳性(-)，棕色为阳性(+)，棕褐色为强阳性( )。IL 1 在不同胃黏膜病变组织中的表达见表 2。经 2 检验，慢性萎缩性胃炎组与慢性浅表性胃炎组比较，P=0.00;肠腺化生组与慢性浅表性胃炎组比较，P=0.02;异型增生组与慢性浅表性胃炎组比较，P=0.00;肠腺化生组与异型增生组比较，P=0.01。均有显著性差异。表 2 IL 1 在不
16、同胃炎组中的表达3 讨 论幽门螺杆菌与胃炎、消化性溃疡及胃癌等许多疾病的发生有关。世界卫生组织国际癌症研究机构在 1994 年年鉴中已将其列为人类胃癌的第一致癌原4。然而6世界上约有半数人口感染了 Hp，但不同个体感染 Hp 的后果差异很大，有的为无症状的携带者，有的发生消化性溃疡，而部分患者可发生胃癌，其中的机制尚不清楚。宿主因素、幽门螺杆菌毒力型在发病中是否起很大的作用，是目前研究的重点。幽门螺杆菌是一种微需氧的革兰氏阴性菌，培养需要较高的条件，因此培养的阳性率相对较低，本研究培养阳性率仅为 58.5%。CagA 蛋白是由 cagA 基因编码的一种分子质量为 120140ku 的具有强免疫原性的外膜蛋白。CagA 的功能尚未完全明确。胃癌的发生是一个多阶段、多因素的过程。肠上皮化生和非典型增生可能是幽门螺杆菌感染起主要作用的起始阶段。肠上皮化生是
