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1、1comHLAA2 限制性 CTL 表位 HPV18E7715 分子修饰肽的免疫原性鉴 定作者：邵笑红 欧荣英 徐云升 张学奇 蔡剑峰 李秉煦【摘要】 目的：对 HLA A2 限制性细胞毒性 T 淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)表位 HPV18E77 15 进行氨基酸置换修饰,探讨修饰肽的免疫原性。方法：采用细胞毒实验(51Cr 释放法)，以包被了九肽的 T2 细胞作为靶细胞，以九肽诱导的 HLA A2 阳性人外周血单个核细胞为效应细胞，观察目标肽是否具有诱导特异性 CTL 杀伤效应。结果：修饰肽符合 HLA A2 分子限制性细胞毒性 T 细胞的表位要求，具有特
2、异性细胞毒性 T 细胞诱导活性。结论：修饰肽具有较强的抗原性，可以作为高危型 HPV 感染治疗性肽疫苗分子设计的候选表位。 【关键词】 人乳头状瘤病毒 E7 抗原 表位 HLA A2 CTL 免疫原性 分子修饰Abstract Objective:To investigate the immunogenicity of peptide modified by amino acid substitution for the cytotoxic T lymphocytes (CTLs) epitope HPV18E77 15 restricted by HLA A2.Methods:51Cr re
3、lease assay was used to determine their abilities of inducing the generation of specific CTLs.Results:The modified peptide TLQDIVLHV met the requirements of HLA A2 restricted CTL epitopes and had the abilitiy of inducing the generation of specific CTLs.Conclusion:The modified peptide TLQDIVLHV may h
4、ave better antigenicity and affinity to HLA A2,and can be used as one of the HLA A2 restricted candidate epitopes for therapeutic peptide vaccine against HPV infection.Key words papillomavirus,human E7 antigen epitopes HLA A2 cytotoxic Tlymphocyte molecular modification高危型人乳头瘤病毒(human papillomavirus
5、,HPV)的 16 型、18 型感染可导致尖锐湿疣、宫颈上皮内瘤和宫颈癌等疾病1。该病毒基因组依据其功能的活动时段2不同可分为 3 个编码区，其中早期区(early region，E 区)分别编码E1、E2、E4、E5、E6、E7 六个早期蛋白，主要参与病毒 DNA 的复制、维持细胞内HPV 拷贝数、以及转录和翻译调控等功能。病变及周围组织大多可以持续检测到HPV E7 蛋白的表达，以该蛋白为靶抗原的人白细胞抗原(human leukocyte antigen,HLA)A2 分子限制性细胞毒性 T 淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)表位的筛选和鉴定具有重要意义，也
6、是这类疾病治疗性肽疫苗研究的传统思路和热点所在2。在针对靶抗原 E7 蛋白的治疗性疫苗研究方面，为了确定与 CTL 的 T细胞抗原受体(T cell antigen receptor，TCR)或靶细胞表面主要组织相容性复合物(Major histocompatibility complex，MHC)类分子具有高亲和力的表位，对表位进行氨基酸置换修饰3，修饰后可以有效提高表位结合力同时保持抗原特异性的新表位具有重要意义4。本研究探讨对 HPV18E77 15 进行氨基酸置换修饰后修饰肽的免疫原性。1 材料与方法1.1 HPV18E77 15 修饰肽的制备 HPV18E7715 原有序列(TLQD
7、IVLHL)第 9 位氨基酸 L 置换为 V，则修饰肽序列改为(TLQDIVLHV)。1.2 修饰肽的免疫原性鉴定采用细胞毒实验(51Cr 释放法)。以包被了九肽的 T2 细胞作为靶细胞，以九肽诱导的 HLA A2 阳性人外周血单个核细胞为效应细胞，观察目标肽是否具有诱导特异性 CTL 杀伤效应。31.3 靶细胞的制备取生长良好的 T2 淋巴细胞，RPMI 1640 培养液离心洗涤 2 次，使用前用各多肽包被并孵育 4 小时,每 106 T2 细胞加入多肽 10g。1.4 效应细胞取 HLA A2 健康献血者静脉血 200ml,采用淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞 PBMC，并分装 6 个培
8、养瓶进行培养,用 10%FCS RPMI 1640 培养液调细胞浓度为 1106/ml，分别加入多肽和对照用无关肽,多肽质量浓度为 10ug/ml,共 3次刺激,每次间隔时间为 1 周,每次刺激前均需洗涤和重悬 PBMC 并加入白介素(每毫升加 100U),最后 1 次刺激 3 天后收集效应细胞。1.5 靶细胞的标记孵育后每孔加入 3700kBq Na51CrO4，37 5%CO2 孵育 90min。用 RPMI 1640培养液离心洗 2 次，收集标记的靶细胞，用 10%FCS RPMI 1640 培养液调细胞浓度至 1105/ml。1.6 测 定分别取效应细胞 100l，放射性核素标记的靶细
9、胞 50l 和抗 CD3 单克隆抗体50l，加入 96 孔培养板中。同时设自然释放对照孔(靶细胞+10%FCS RPMI 1640培养液 150l)，最大释放对照孔(标记的靶细胞+2%Triton X 100 150l)和自然杀伤细胞活性对照孔(标记靶细胞+效应细胞),3 复孔。室温，800r/min 离心5min，37 5%CO2 孵育 4 小时。吸取培养上清液 100l， 计数器测 cpm 值。4检测的效靶比为 51，每组做 3 个复孔5，51Cr 特异释放率为：(实验组 脉冲数平均值-对照组 脉冲数平均值)/(破坏的靶细胞组 脉冲数平均值-对照组 脉冲数平均值)。2 结 果细胞毒实验结果
10、显示，修饰肽(TLQDIVLHV)和原有序列(TLQDIVLHL)均可以诱导特异性 CTL 杀伤效应，三组 51Cr 特异释放率分别为 64.6%、72.2%和 1.4%。修饰肽保留了修饰前的抗原特异性，对照肽无明显诱导活性，见图 1。图 1 51Cr 特异释放率3 讨 论人体感染的 HPV 常见型别包括良性型 HPV6、11 型和恶性型 HPV16、18 型等。HPV 感染后可导致尖锐湿疣、宫颈上皮内瘤和宫颈癌等疾病，特别是恶性型 HPV感染与宫颈癌的发生密切相关6。HPV 基因组中 E 区可分为 8 个开放读码框，E7主要与细胞转化功能及致癌有关，作为靶抗原在研究中倍受重视7。虽然 CTL
11、 在识别 HPV 抗原，特别是 E7 抗原和清除 HPV 感染中起重要作用， E7 抗原可能含有与表位竞争结合的抑制性多肽序列，其结合力高于表位本身，但不具备相应的抗原性。因此，探讨 E7 抗原所包含的对表位起抑制作用的多肽序列，并据此对表位进行提高结合力的置换修饰，具有重要的临床意义。但是一旦进行氨基酸置换修饰，是否保留了原有的抗原性就有待进一步证实。本研究对 HPV18E77 15 原有序列(TLQDIVLHL)第 9 位氨基酸 L 置换为 V 后其修饰肽序列改为(TLQDIVLHV)进行免疫原性鉴定，目的是确定修饰肽在提高结合力的同时是否保留了原有的抗原特异性。5本实验在抗原性鉴定上采用
12、标准 51Cr 释放法，该方法缺点在于受同位素半衰期影响，不容易配合好效应细胞和靶细胞的培养时间。因此，在细胞培养前，研究者首先确定同位素到达的准确时间，之后再开始后续实验。实验结果表明，本次置换后的序列(TLQDIVLHV)和原有序列(TLQDIVLHL)均可以诱导特异性 CTL 杀伤效应，修饰肽保留了修饰前的抗原特异性，对照肽则无明显诱导活性。因此，可以考虑将修饰肽作为肽疫苗的候选表位之一8。【参考文献】1 Smahel M,Tejklova P,Smahelova J,et al.Mutation in the immunodominant epitope of the HPV16 E7
13、 oncoprotein as a mechanism of tumor escapeJ.Cancer Immunol Immunother,2008,57(6):823 831.2 Nilres K,Hohn H,Pilch H,et al.Human papillomavirus type 16E7 peptide directed CD8 T cells front patients with cervical cancer are cross reactive with the corenavirus NS2 proteinJ.J Viml,2003,77(9):5464 5474.3
14、 Khan MJ,Castle PE,Lorinez AT,et al.The elevated 10 year risk of cervical precancer and cancer in women with human papillomavirus(HPV) type 16 or 18 and the possible utility of type specific HPV testing in clinical practiceJ.J Natl Cancer Inst,2005,97(14):1072 1079.4 欧荣英，徐云升，林治华，等.十肽表位 HPV16E711 20
15、氨基酸置换修饰的研究J.中华微生物与免疫学杂志，2006，26(11)：990 993.5 Wiethe C,Dittmar K,Doan T,et al.Provisionof 4 1BB ligand enhances effector and memory CTL responses generated by immunization with dendritic cells expressing a human tumor associated antigenJ.J Immunol,2003,170(6):2912 2922.6 田启龙.穿刺置疣术治疗尖锐湿疣 97 例对比观察J.中国
16、艾滋病性病，2009，15(1)：77.7 Hung CF,Monie A,Alvarez RD,et al.DNA vaccines for cervical cancer:from bench to bedsideJ.Exp Mol Med,2007,39(6):679 689.68 Lowy DR,Schiller JT.Prophylactic human papillomavirus vaccines J.J Clin Invest,2006,116(5):l167 1173.2 结 果细胞毒实验结果显示，修饰肽(TLQDIVLHV)和原有序列(TLQDIVLHL)均可以诱导特异性 CTL 杀伤效应，三组 51Cr 特异释放率分别为 64.6%、72.2%和 1.4%。修饰肽保留了修饰前的抗原特异性，对照肽无明显诱导活性，见图
