《IgG刺激诱发的小胶质细胞Toll样受体4表达及细胞因子分泌》由会员分享,可在线阅读,更多相关《IgG刺激诱发的小胶质细胞Toll样受体4表达及细胞因子分泌(6页珍藏版)》请在金锄头文库上搜索。
1、1IgG 刺激诱发的小胶质细胞 Toll 样受体 4 表达及细胞因子分泌作者:吴瑞, 刘玲, 彭正午, 段小莉, 王百忍, 靳亚平, 邝芳【摘要】 目的: 了解在体外培养条件下免疫球蛋白 G (IgG) 刺激对小胶质细胞表达 Toll 样受体 4(TLR4)和分泌细胞因子的作用。方法: 用不同浓度的 IgG (2 mg/L、 20 mg/L、 200 mg/L)及脂多糖(LPS)(10 mg/L)刺激原代培养的大鼠小胶质细胞, 24 h 后以免疫荧光染色观察 TLR4 的表达, ELISA 法检测培养上清中肿瘤坏死因子 (TNF )和 干扰素(IFN )的含量。结果: IgG 直接作用于体外培
2、养的小胶质细胞后, 以剂量依赖的方式引起 TLR4 的表达和 TNF 的分泌, 但未检测到 IFN 含量的变化。作为阳性对照的 LPS 引起了小胶质细胞 TLR4 表达, 并诱导了 TNF 及少量 IFN 的分泌。结论: 同种 IgG 刺激可使体外培养的小胶质细胞大量表达 TLR4, 可能通过 MyD88 依赖途径导致炎性细胞因子分泌。结果提示至少在中枢神经系统的固有免疫反应中, TLR4 可能发挥识别病原体之外的蛋白分子, 例如 IgG 的作用。 【关键词】 小胶质细胞; 免疫球蛋白 G; Toll 样受体 4; 肿瘤坏死因子 ; 干扰素AbstractAIM: To investigate
3、 the effects of immunoglobulin G(IgG) on the expression of toll like receptor 4 (TLR4) and secretion of cytokines in microglial cells in vitro. METHODS: Cultured primary rat microglial cells were stimulated with different concentrations of rat IgG (2 mg/L, 20 mg/L, 200 mg/L) and lipopolysaccharide (
4、LPS) 10 mg/L for 24 h, respectively. The TLR4 expression in the microglial cells was examined by immunofluorescence staining and tumor necrosis factor (TNF ) and interferon (IFN ) levels in the culture medium were assayed by ELISA. RESULTS: IgG stimulation induced a significant TLR4 expression and T
5、NF secretion in cultured microglial cells in a dose dependent manner, while IFN was not detected in the same medium samples. As a positive control, LPS caused increases of TLR4 expression and both IFN and TNF production in the microglial cells. CONCLUSION: TLR4 expression could be induced in microgl
6、ia in 2vitro by non pathogenic protein, IgG from the same species. Therefore, congeneric IgG stimulation might lead to proinflammmatory cytokine production, probably via MyD88 dependent pathway. This finding suggests that TLR4 may play more roles than pathogen recognition of innate immune reactivity
7、, at least in the central nervous system.KeywordsMicroglia; Immunoglobulin G; Toll like receptor 4; Tumor necrosis factor ; Interferon 固有免疫(innate immunity)是生物体在进化过程中获得的具有普遍性的防御机制, 是宿主对抗病原侵袭的第一道防线, 在获得性免疫(adaptive immunity)系统被活化前发挥抗感染作用1。Toll 样受体 4(TLR4)是革兰氏阴性细菌胞壁产物脂多糖(LPS)的特异性识别受体, 对病原体识别有重要作用2。中枢神
8、经系统(central nervous system, CNS)因被血脑屏障(Blood brain barrier, BBB)保护、 缺乏淋巴系统及没有免疫细胞而被认为是“免疫特免区”, 但脑内很多疾患的发生发展中均伴有免疫反应。研究发现, TLR4 mRNA 广泛表达在中枢神经系统, 如脑膜, 脉络丛和室周器官3, TLRs 也表达于小胶质细胞, 如人的小胶质细胞也表达TLR44, 在中枢神经系统的细菌或病毒的识别和免疫应答的产生过程中起关键作用5。肥大细胞、 T 细胞和 IgG 在某些生理或病理条件下可以通过 BBB 渗入脑内6。我们以前的研究发现, 静脉注射肾上腺素引起的动物一过性高血
9、压可使BBB 开放, 血液循环中的内源性 IgG 可因此进入脑内, 并被小胶质细胞吞噬7。据报道, TLR4 在 CNS 主要表达在小胶质细胞上而不是寡突胶质细胞或者神经元8; 而且体外培养的小胶质细胞在 LPS 作用下可以被激活而释放 IL 1、 TNF 以及其他多种炎性分子9。那么非特异性 IgG 在进入 CNS 后是否会引起炎症反应、 是否通过小胶质细胞表面模式识别受体 TLRs 活化而产生固有免疫应答目前仍不清楚。为此, 我们在体外培养条件下观察了 IgG 刺激后小胶质细胞3TLR4 的表达以及细胞因子的分泌情况, 以探讨 TLR4 是否参与 IgG 引起的小胶质细胞的反应机制。1 材
10、料和方法1.1 材料新生 1 d SD 大鼠由第四军医大学实验动物中心提供。LPS(E.coli 0127: B8)购自美国 Sigma 公司。纯化的大鼠 IgG 购自北京中山公司。小鼠抗大鼠 TLR4 购自英国 Abcam 公司, 兔抗大鼠 Iba 1 购自日本 Wako 公司, Alexa 488 结合的驴抗小鼠 IgG 和 Alexa 594 结合的驴抗小鼠 IgG 购自美国 Molecular Probes 公司。大鼠 TNF 和 IFN ELISA 试剂盒购自晶美生物公司。1.2 方法1.2.1 小胶质细胞的分离培养新生 1 d 鼠 10 只, 无菌条件下剪开颅骨, 取出脑组织, 分
11、离皮层至含D Hanks 液的培养皿中反复冲洗以去除血污, 在解剖显微镜下轻轻剥去脑膜和血管, 用 D Hanks 液洗 12 次。剪碎组织块至 12 mm, 加入体积比组织块总量多 3050 倍的 0.125 g/L 胰酶, 37下消化 25 min, 加入含 100 mL/L 胎牛血清的完全 DMEM 培养液终止消化 78 min, 吸出组织至另一含 100 mL/L 胎牛血清的完全 DMEM 培养液的离心管, 吹打制成单细胞悬液, 静置, 收集上清液, 接种于细胞培养瓶中, 置于 37、 50 mL/L CO2 培养箱, 培养 1012 d。取出, 将培养瓶放在 260 r/min 的摇
12、床上振摇 1 h, 收集上清, 离心, 沉淀细胞, 再以完全DMEM 重悬细胞, 接种于 24 孔板(孔中铺有多聚赖氨酸包被好的玻片), 37 50 mL/L CO2 培养箱培养。41.2.2 细胞处理将接种于 24 孔板的小胶质细胞于 37、 50 mL/L CO2 培养箱继续培养 23 d, 加入 IgG(终浓度分别为 2 mg/L、 20 mg/L、 200 mg/L), LPS(终浓度 10 mg/L)作为阳性对照。IgG 和 LPS 均以不含血清的 DMEM 配成, 并以同样的不含血清的 DMEM 做空白对照。作用 24 h 后收集上清液, 同时取细胞爬片做免疫荧光染色。1.2.3
13、免疫荧光染色以 40 g/L 多聚甲醛固定细胞爬片, 室温, 20 min, 0.01 mol/L PBS 洗 3 次, 每次 5 min。以 10 g/L 的小牛血清白蛋白(BSA)封闭, 室温, 30 min。0.01 mol/L PBS洗 5 min3。抗大鼠 TLR4 抗体(1100)和抗大鼠 Iba 1 抗体(1800)混合后孵育, 室温过夜。0.01 mol/L PBS 洗 5 min3, Alexa 594 结合的驴抗大鼠 IgG (1800)和Alexa 488 结合的驴抗大鼠 IgG(1400)混合孵育, 室温避光 3 h, 用以结合上述抗大鼠抗体, 再用 Hoechest
14、33258 室温衬染细胞核 20 min。以上两步骤间均用 0.01 mol/L PBS 充分漂洗 3 次, 每次 10 min, 然后用 50%甘油 PBS 溶液封片, 于Olympus FV1000 共聚焦显微镜下观察结果。1.2.4 双抗夹心 ELISA 法测细胞培养上清中 TNF 和 IFN 水平收集上清液, 按照试剂盒说明检测 TNF 和 IFN 水平, 呈色后以酶标仪450 nm 测定吸光度, 数据经换算成浓度(xs)后以 SPSS 软件进行单因素方差分析, P0.05 时差异有统计学意义。2 结果52.1 小胶质细胞的纯化经免疫荧光染色鉴定, 收集到的小胶质细胞纯度90%(小胶质
15、细胞标志物Iba 1 的免疫荧光染色, 图 1 A)。 2.2 TLR4 免疫荧光染色同种 IgG 直接作用于体外培养的小胶质细胞 24 h 后, 细胞中可见可大量表达的 TLR4 免疫阳性产物(图 1D、 E、 F 箭头所示黄色标记), 分布于胞膜和胞浆。而且随着 IgG 浓度增加, 表达 TLR4 的小胶质细胞数量有增加的趋势, 其形态也发生改变, 胞体增大, 并向外伸出一些伪足, 呈煎鸡蛋型。LPS 阳性对照组的小胶质细胞也表达 TLR4(图 1C 箭头所示), 但细胞形态改变不大, 与空白对照组(图1B)的细胞相似。2.2 细胞因子含量变化在 LPS 阳性对照组的胶质细胞的培养上清中检
16、测到有微量的 IFN 分泌(数据未显示), 而在不同浓度 IgG 刺激的各组小胶质细胞培养上清中均未能检测到IFN 。IgG 刺激小胶质细胞分泌 TNF 与空白对照组相比显著升高(P0.05): IgG 2 mg/L 组为(146.6726.5) ng/L, IgG 20 mg/L 组为(291.3310.7) ng/L, IgG 200 mg/L 组为(386.3356.77) ng/L。LPS 组为(580.722.01)ng/L, 空白组为(230.324.9)ng/L(图 2)。与空白对照组相比, IgG 20 mg/L、 200 mg/L 刺激组明显增高, 差异极显著(P0.01), 且 TNF 分泌量与 IgG 的浓度有剂量依赖倾向(图 2)。3 讨论TLR4 炎症信号通路的激活不仅导致轻微的炎症反应, 而且刺激机体产生并释放6大量细胞因子抵