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1、1GSTP1 基因多态性与胃黏膜肠上皮化生 的关系作者：王旭光，袁权，张忠，韩莹，王艳宁，韩云飞【摘要】 目的：了解胃黏膜肠上皮化生(肠化生)人群 Pi 类谷胱甘肽转移酶基因(GSTP1)不同等位基因的分布，探讨肠化生癌变的内在遗传特性。方法：利用PCR RFLP 法检测 92 例正常人群、55 例肠化生组和 103 例胃癌组 GSTP1 不同等位基因的分布。结果：与正常对照组相比，具有 A/G 或 G/G 基因型者发生肠化生的风险增加到 2.075 倍(95%CI，0.9904.348)， 罹患胃癌的风险性增加 2.730倍(95%CI，1.3805.400)。结论：具有 A/G 或 G/G
2、 基因型者发生肠化生和胃癌的风险性增加;此种肠化生与胃癌有着相似的遗传特性，可作为癌前肠化生进行随访。【关键词】 肠化生;多态性;胃癌;人群 Pi 类谷胱甘肽转移酶基因AbstractObjective：To analysis the distribution of polymorphism of GSTP1 in intestinal metaplasia (IM) of gastric cancer ， and to assess the risk of carcinogenesis of IM. Methods：Polymerase chain reaction (PCR) and re
3、striction fragment length polymorphism (RFLP) were to analyze genotype of 103 gastric cancer，55 IM and 92 hospital controls.Results： The subjects with A/G or G/G genotype of GSTP1 genes had an increased risk of developing IM(OR：2.075， 95%CI： 0.9904.348)， and gastric cancer (OR： 2.730，95%CI：1.3805.40
4、0). Conclusions：Individuals with GSTP1 A/G or G/G genotype show an increased risk in developing IM and gastric cancer.IM patients with A/G or G/G genotype have the genetic characteristics similar to those of gastric cancer ，so they should be regarded as high risk individuals of gastric cancer and fo
5、llowed up regularly.Key wordsintestinal metaplasia;polymorphism;gastric cancer;GSTP1肠化生是一种常见的胃黏膜病变，经常出现在胃癌发生之前，被认为是胃癌的2癌前病变1，2。然而，并不是所有的肠化生患者均发展为胃癌，究竟何种肠化生才是可癌变的肠化生，是一个需要明确的问题。以往的研究多着重于肠化生的形态学特性与胃癌的关系，对肠化生患者内在的遗传学特性研究甚少。基因多态性是指在一个生物群体中，同时和经常存在两种或多种不连续的变异型或基因型，携带某种多态片段的人群常与某种疾病发病率相关，因此人们通过检测某种基因的多态性来
6、判断某种疾病的易感性。目前发现许多基因的多态性与胃癌易感性相关，其中代谢酶基因多态性与胃癌的关系是近年研究热点。GSTP1 是 II 相代谢酶谷胱甘肽 S 转移酶(GSTs)家族中一员，人们发现 GSTP1 第 5 外显子多态性与胃癌在内的多种肿瘤关系密切3，4。但是，GSTP1 多态性与肠化生的关系如何尚不清楚。本研究检测正常人群、肠化生和胃癌人群 GSTP1 第 5 外显子的多态性，探讨 GSTP1 是否可以作为预报肠化生癌变的指标。1 对象与方法1.1 对象 本研究选用的病例分别来自 2002 至 2005 年辽宁省庄河市中心医院和中国医科大学第一临床医院胃癌筛查者。本研究经中国医科大学
7、伦理委员会批准，以问卷调查和病例记录方法收集所有研究对象的年龄、性别和相关资料，并与患者签署了知情同意书。采集受检者空腹静脉血，分离血清和凝血块后-20 保存，凝血块用于GSTP1 多态性的检测;同时对患者进行胃镜检查并于胃体、胃角及胃窦和病灶处取胃黏膜，钳取后立即用 95%的乙醇固定，然后用石蜡包埋，制成 4 张 5 m 切片，镜检， 进行病理学诊断。本研究选取 250 例患者进行研究，其中男 154 例(61.6%)，女 96 例(38.4%)，年龄 2484 岁，平均年龄(5212)岁。31.2 方法1.2.1 病理诊断 常规 HE 染色，经两名病理医生，采用双盲法进行病理诊断，将病例分
8、为正常对照组 92 例，肠化生组 55 例，胃癌组 103 例。1.2.2 DNA 提取 从凝血块中提取 DNA，用标准的酚-氯仿抽提法5。1.2.3 PCR RFLP 检测 依据文献6对 GSTP1 基因(GDB X08058)第 5 外显子进行扩增，引物序列如下：正链 5GTA GTT TGC CCA AGG TCA AG 3反链 5AGC CAC CTG AGG GGT AAG 3。反应体系：分别加10buffer(含 MgCl2 25 mmol/L)5l，dNTP 4l(浓度)，上下游引物(10pmol/l)各0.5 l，Taq DNA 酶 0.4 l，模板 DNA 1 l，加去离子水
9、至总体积 50 l。PCR 反应条件：9512 min，9530s，5830s，7260s 15 个循环;9530s，5530s，7260s 25 个循环;725 min，4保存。利用 BsmA I 限制性内切酶(NBI)对 PCR 产物置于 37 恒温箱中进行酶切 3 h，然后取酶切产物 20 l，用 2.5%琼脂糖凝胶电泳分离，溴化乙锭染色 5min 后观察 DNA 条带变化。1.2.4 统计学方法 以 2 检验比较各组基因频率的差异，P0.05 有统计学意义。以比值比(OR)及其 95%可信区间(CI)表示各基因型发生不同疾病的风险。OR值以非条件 Logistic 回归计算。所有统计检
10、验均为双侧概率检验。统计分析采用SPSS11.5 软件进行分析。2 结果2.1 GSTP1 基因 105 位点 A/G 多态图谱 第 5 外显子 AG 碱基改变可导致蛋4白质肽链第 105 位点氨基酸由 ATC 异亮氨酸(Ile)变为 GTC 缬氨酸(Val)。经限制性内切酶酶切后，GSTP1 出现 3 个分子量不同的酶切片断，分别是 329 bp，222 bp，107/104 bp，呈现 3 种图谱改变(图 1)，第 1 种为 A/A 纯合子，具有 329 bp和 107 bp/104 bp 等位基因片段;第 2 种为 A/G 杂合子改变，具有 329 bp，222 bp，107/104 b
11、p 等位基因片段;第 3 种为 G/G 纯合子突变型，具有 222 bp，107/104 bp 等位基因片段。图 1 PCR 扩增的 GSTP1 基因片断经 BsmA I 限制性酶切后的琼脂糖凝胶电泳图谱 GSTP1 基因经 BsmA I 酶切后出现 3 个分子量不同的等位基因片断，分别是 329 bp，222 bp，107/104 bp ，M 泳道为 DNA marker (DL2000);2，3，5，7，9-12 泳道为 A/A 纯合子基因型;4，6 泳道为 A/G杂合子基因型;1 泳道为 G/G 纯合子基因型，8 泳道为阴性。 2.2 不同疾病组GSTP1 基因型频率的分布 由于 G/G
12、 基因型检出率很低，将 A/G 和 G/G 基因型和为一组 与 A/A 基因型进行比较。Logistic 多因素分析结果显示，经性别年龄调整后，肠化生组和胃癌组 A/G 和 G/G 基因型频率显著升高。具有 A/G 或 G/G 基因型者发生肠化生的风险增加到 2.075 倍(95%CI，0.9904.384)，发生胃癌的风险性增加 2.730 倍(95%CI，1.3805.400)，见表 1。表 1 不同疾病 GSTP1 基因型频率比较3 讨论胃癌的发生是内在遗传因素和外在环境因素共同作用的结果，肠化生是胃癌发生之前的重要环节，同样也受到内外因素的影响。个体对环境致癌物的代谢不仅有相代谢酶的参
13、与，相代谢酶也同样发挥着重要的作用。I 相代谢酶主要5对外来化合物进行生物转化， II 相代谢酶则对相反应代谢活化所产生的亲电子中间体与体内的化合物进行结合反应。GSTs 属相代谢酶， 能催化亲电子致癌物与谷胱甘肽结合， 形成易溶于水的化合物排出体外， 是与毒物或致癌物解毒代谢有关的酶类。除此之外，GSTs 还具有对其他酶或蛋白的调节作用， 参与DNA 的修复， 因而 GSTs 有助于维持细胞基因组的完整性，他们的变异和多态性会影响到个体对肿瘤或某种疾病的易感性。迄今为止，研究发现 GSTs 存在于多种物种组织中， 在消化系统上皮组织中相对较多。在正常胃黏膜中，GSTP1 是重要的一种 GST
14、s 亚型， 主要参与烟草中致癌物的代谢。GSTP1 基因编码的酶可催化一系列底物亲电子中心与还原型谷胱甘肽轭合， 从而在外源化合物的代谢过程中起重要作用。第 1 期王旭光等.GSTP1 基因多态性与胃黏膜肠上皮化生的关系正因为 GSTP1 与外源性致癌物代谢密切相关，人们开始对其基因多态性进行了广泛的研究，发现该基因存在两个多态性位点，一个是第 5 外显子 1587 对碱基处 AG，导致 Ile(异亮氨酸)-105Val(缬氨酸)，另一个是第 6 外显子 2293 对碱基处 CT，导致 Ala(丙氨酸)-114Val。研究显示 GSTP1 第 5 外显子与乳腺癌、大肠癌、前列腺癌、宫颈癌、肺癌
15、和慢性阻塞性肺疾病7-13等多种疾病的发生有关。因此本研究检测 GSTP1 基因第 5 外显子的多态性与肠化生的关系，来寻找可癌变肠化生内在的遗传证据。正常对照组、肠化生组和胃癌组 GSTP1 第 5 外显子不同基因型分布频率。结果显示，正常组以 A/A 基因型为主，肠化生组和胃癌组以 A/G 和 G/G 基因型为主;肠化生和胃癌组 A/G 和 G/G 基因型频率高于正常对照组。结果提示，具有 A/G 或6G/G 基因型者发生肠化生和胃癌的风险性增加。具有 A/G 或 G/G 基因型者因碱基发生 AG 置换，使其编码的蛋白质由异亮氨酸(Ile)变为缬氨酸(Val)，进而热稳定性及其他功能也发生
16、了改变，有研究证实位于第 105 位点氨基酸的替代改变了氨基酸的体积和疏水性，从而影响了酶的热稳定性。还有文献报道 GSTP1 酶- Val105(含 G 等位基因)的热稳定性比 GSTP1 酶- Ile105(不含 G 等位基因)的低23 倍14。因此，GSTP1 编码蛋白质功能的改变，使机体对外界的解毒功能降低，推论当具有 A/G 或 G/G 基因型的个体在受到外界损伤后，机体对抵抗外界致癌物损伤的能力降低，从而更易被损伤，黏膜的结构遭到破坏，即具有了发生肠化生和胃癌的遗传基础。此种肠化生可作为癌前肠化生进行随访。【参考文献】1Kang KP， Lee HS， Kim N，et al . Role of intestinal metaplasia subtyping in the risk of gastric cancer in KoreaJ.J Gastroenterol Hepatol，2009，24：140-
