《罗格列酮对高糖诱导大鼠胸主动脉平滑肌细胞增殖和凋亡的影响》由会员分享，可在线阅读，更多相关《罗格列酮对高糖诱导大鼠胸主动脉平滑肌细胞增殖和凋亡的影响（76页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、英文缩写D MA SV S M C s英文缩写D i a b e t e sm e l l i t u sA t h e r o s c l e r o s i sV a s c u l a rs m o o t hm u s c l ec e l l sb c l - 2Bc e l ll y m p h o m a l e a k m i a - 2BP P A R yT Z D sR S G T 2 D MM T TD M S 0 D M E MC V DP e r o x i s o mp r o l if e r a t o ra c t i v a t e dr e c e p t
2、 o r - g a m mT h i a z o l i d i n e d i o n e sR o s i g li t a z o n eT y p e2d i a b e t e sm e l l i t u s糖尿病动脉粥样硬化血管平滑肌细胞细胞淋巴瘤白血病2过氧化物酶增生激活受体丫噻唑烷类二酮药物罗格列酮2 型糖尿病3 ( 4 ，5 - d i m e t h y l t h i a z o l - 2 一y 1 ) 一2 ，5四甲基偶氮唑蓝- d i p h e n y l t e t r a z o l i u mb r o m i d eD i m e t h y ls u
3、 l f o x i d e二甲基亚砜D u l b e c c o Sm o d i f i e dD M E M 培养基E a g l e sm e d i u mC a r d i o v a s c u l a rd i s e a s e心血管疾病河北医科大学 学位论文使用授权及知识产权归属承诺本学位论文在导师( 或指导小组) 的指导下，由本人独立完成。本学位论文研究所获的研究成果，其知识产权归河北医科大学所有。河北医科大学有权对本学位论文进行交流、公开和使用。凡发表与学位论文主要内容相关的论文，第一署名单位为河北医科大学，试验材料、原始数据、申报的专利等知识产权均归河北医科大学所有
4、。否则，承担相应的法律责任。研究生签名：幂江枣皇导师篷易占访酶院领导签名： 彻譬年多月2 1 日河北医科大学研究生学位论文独创性声明本论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果，除了文中特别加以标注和致谢等内容外，文中不包含其他人已经发表或撰写的研究成果，指导教师对此进行了审定。本论文由本人独立撰写，文责自负。研究生签名：粱殂桃导师签名：之，仍匕勰年歹。月2 7 日中文摘要罗格列酮对高糖诱导大鼠胸主动脉平滑肌 细胞增殖和凋亡的影响摘要目的：血管并发症是糖尿病( d i a b e t e sm e l l e t u s ，D M )患者致死的首要原因，动脉粥样硬化( a t h e r
5、 o s c l e r o s i s ，A S )与D M 共存。D M 患者血糖控制不理想与微血管和大血管病变紧密相关，高血糖在D M 血管并发症的发展过程中起着主要作用。血管平滑肌细胞( v a s c u l a rs m o o t hm u s c l ec e l l s ，V S M C s ) 的过量增生是A S 的一个主要特征。已证实，细胞增生是内膜增厚的基本特征之一，但现在普遍认为细胞凋亡调节的紊乱也同样重要。A S 中V S M C s 的大量聚集是细胞高度增生和凋亡减少共同作用的结果。许多研究证实，高浓度葡萄糖可促进A S 的发展，增加体外V S M C s 的生长
6、率。高糖不仅能显著抑制无血清诱导的体外培养大鼠V S M C s 的凋亡，还能增强抗凋亡蛋白B c l 2 和B c l x l 的表达，此外明显降低人冠状动脉平滑肌细胞的D N A 断裂率。过氧化物酶体增殖物激活受体Y ( P e r o x i s o m eP r o l i f e ：r a t o r A c t i v a t e dR e c e p t o r sY ，P P A R 7 ) 是核受体超家族的一个转录因子。P P A I q 在V S M C s 有表达，在机械损伤的动脉壁中表达显著上调。罗格列酮( r o s i g l i t a z o n e ，R S
7、G ) 属于噻唑烷类二酮药物( t h i a z o l i d i n e d i o n e s ，T Z D s ) ，为P P A I 人工合成配体，是临床上用于治疗D M 的胰岛素增敏剂。许多资料显示，T Z D s还可延缓A S 进程。R S G 可减少颈总动脉内膜中层厚度( I M T ) ，而后者是冠状A S 的预测指标。R S G 还可减少D M中文摘要小鼠的动脉粥样斑块总面积并抑制斑块中巨噬细胞的聚集。在离体实验中，R S G 可抑制人V C S M s 增殖并促进其凋亡，但对于高糖诱导的V C S M s 增殖、凋亡及其相关分子机制的影响鲜有报道。本实验通过原代培养大鼠
8、胸主动脉V S M C s ，研究R S G 对高浓度葡萄糖孵育下的V S M C s 增殖、凋亡以及B c l 2 、B c l x l 的影响，探讨R S G 对A S 的作用机制。方法：1 运用改良组织贴块法进行大鼠胸主动脉V S M C s 原代培养并传代，应用自然纯化方法纯化细胞，根据细胞形态学特点和0 c a c t i n 免疫细胞化学染色进行细胞鉴, - a - r 疋；2 取处于对数生长期的第5 - 6 代细胞，用M T T 法检测不同浓度R S G 对高糖孵育下细胞增殖活性的影响；3 取处于对数生长期的第5 - 6 代细胞，流式细胞术检测R S G 对高糖孵育下细胞周期、凋
9、亡率及B c l 2 、B c l x l 蛋白表达的影响；4 取处于对数生长期的第5 “代细胞，W e s t e r nb l o t 技术检测R S G 对高糖孵育下细胞B c l 一2 、B c l x l 蛋白表达的影响。结果：1 原代培养时约8 0 的组织块接种成活，培养细胞呈典型的“谷峰状“ 生长，经平滑肌细胞特异的c 【a c t i n免疫化学染色后，培养细胞的胞浆着色呈阳性反应；2 用M T T 法检测V S M C s 的增殖活性，发现在高浓度葡萄糖诱导下，V S M C s 显著增殖( P 1 1 0 6 个) ，3 0 0 0r m i n 离心1 0 m i n ，
10、P B S 洗涤并制成单细胞悬液，重复两次，46 0 预冷乙醇( 终浓度为7 0 ) 固定细胞，4 * 0 冰箱保存。研究论文2 4 2 检测细胞周期时相分布10 0 0r m i n 离心4 m i n 弃固定液，冷P B S 再沈2 次，取细胞l x l 0 6 m lO 1m l ( 加入1 0 鸡红细胞作为内参照标准，与样品同步染色) ，加入碘化丙啶( P I ) 染液( P I5 0m g L ，t r i t o n x 1 0 02 m l ，枸橼酸钠2m g ，生理盐水1 3 0m l ，双蒸水7 0m l 混匀) lm l ，4 。C 避光孵育3 0 m i n ，以5 0
11、0 目铜网过滤，使样品成为合格的单细胞悬液，上流式细胞仪检测。实验重复3 次。3 统计学处理所有数据均以i S 表示，应用S P S S l l 5 统计软件进行统计学分析。各组均数的比较行单因素方差分析( A N O V A ) ，用最小显著差法( 1 e a s ts i g n i f i c a n td i f f e r e n c e ，L S D ) 作两两比较，P I 0 为阳性表达，F I 1 0 为阴性表达。2 4W e s t e r nb l o t 法检测细胞B c l 2 、B c l x l 蛋白表达2 4 1 细胞蛋白的提取：取处于对数生长期的第4 6 代细胞
12、接种于培养瓶，待细胞处于对数生长期时，弃除培养液，加入无血清D M E M 培养基，孵育2 4 h 使细胞同步。然后按实验设计分组加药( G W 9 6 6 2 提前半小时加入) 半小时后收集细胞：用P B S 冲沈细胞一遍，0 2 5 胰酶消化，吹打形成单细胞悬液；3 0 0 0r m i n 离心l O m i n ，弃上清，P B S 冲洗，重复两次；3 0 0 0r m i n ，4 离心- 1l m i n ；加入裂解液反复吹打，冰浴3 0 m i n l h ；1 4 0 0 0r m i n ，4 离心l5 m i n ，取上清液分装。2 4 2 考马斯亮兰法测定蛋白含量用考马斯
13、亮蓝法测定胞浆蛋白含量。按试剂盒说明书操作。具体步骤如下：2 4 2 1 原理蛋白质分子具有N H 3 + 基团，当红色的C B B G 2 5 0 显色剂加入蛋白标准液或样品中时，C B B G 2 5 0 染料上的阴离子与蛋白N H 3 + 结合，使溶液变为蓝色，通过测吸光度可计算出蛋白含量。2 4 2 2 试剂配制一墅壅垒查一- I _ _ - - - _ _ _ - _ I _ - _ _ _ _ - _ _ - _ _ _ _ _ _ _ - _ _ _ _ _ - _ _ - _ - _ _ _ _ - 一一一配制蛋白标准品：白蛋白标准品浓度为5 6g L ，以生理盐水稀释成1 9
14、 L 。考马斯亮蓝C B B G 2 5 0 应用液：将储备液临用时用蒸馏水1 ：4 稀释( 即5 倍稀释) 。2混匀，静置10 m i n ，于5 9 5 n m 处，lc m 光径，空白管调零，测各管吸光度。2 4 2 4 计算公式测定管吸光度一空白管吸光度蛋白含量( g L ) =标准管浓度标准管吸光度一空白管吸光度( 班)2 4 3l O 分离胶的配制：蒸馏水4 0m l ，3 0 丙烯酰胺凝胶储存液3 3m l ，1 5cm m o l L 分离胶缓冲液( p H 8 8 ) 2 5m l ，1 0 S D S1 0 0 此，1 0 A P S1 0 0L L l ，T E M E
15、D4l a l 。室温混匀后，倒入垂直玻板之间，之后缓慢加入蒸馏水层约1c m 高，静置直至凝胶形成。2 4 4 浓缩胶的制备研究论文蒸馏水3 6m l ，3 0 丙烯酰胺凝胶储存液O 8m l ，O 5m m o l L 浓缩胶缓冲液( p H 6 8 ) 1 5 2m l ，1 0 S D S6 0 “l ，1 0 A P S6 0g l ，T E M E D6g l 。室温混匀，待分离胶凝固后，将蒸馏水倒出，并用滤纸将余下的蒸馏水吸干净，然后将浓缩胶倒于分离胶之上，迅速插入点样梳( T e f l o n 梳) ，待凝。2 4 5 电泳凝胶完全凝固后，小心取出点样梳，电泳槽加入T r i
16、 s 甘氨酸电泳缓冲液，将2 上样缓冲液与待测样品按1 ：1 比例混匀，煮沸8 m i n ，冷却至室温，加入样品槽内，上样板两边各留1 孔只加上样缓冲液，右边1 孔加预染的蛋白M a r k e r 。然后接通电源，上槽负极，下槽正极，8 0 V 电压，4 。C ，进行电泳，样品在浓缩胶中电泳约1 h ，待样品进入分离胶后，15 0 V 电泳约1 5 h ，直到溴酚蓝到达分离胶的底部，关闭电源。2 4 6 转膜将与凝胶同样大小的N C 膜和6 层滤纸一起浸入转膜缓冲液中，浸泡1 0 m i n 。将电泳完毕的凝胶剥离，在凝胶的底部切去一角作上记号，放入盛有转膜缓冲液的器皿中，平衡5 m i n ，洗去胶上的S D S 等离子。取出转膜夹，放上一块用转膜液浸湿的海绵，按从下到上的顺序依次放上3 层滤纸、凝胶、N C 膜、3 层滤纸，各层之间不能
