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1、1穿孔素在乙肝相关性肾炎的表达及意义【摘要】目的：通过探测 PFP 在 HBV 相关性肾炎的肾组织的表达，以了解 PFP介导的细胞毒作用在 HBV GN 发病中的意义.方法：10 例 HBV GN 活检肾组织，冰冻切片采用免疫组化法（Elivision）的方法检测 HBV GN 肾活检组织中的perforin 的表达.结果：在 HBV GN 肾组织内 perforin 在 2/10 的肾小球表达，3/10在肾小管阳性表达，7/10 肾间质表达.Perforin 在肾小球与肾间质的表达差异有统计学意义(P=0.014，P0.05).肾间质病变轻，中，重度间得 Perforin 表达差异无统计学意
2、义(P0.05).结论：HBV GN 的发病过程中，CD8+CTL 介导的 perforin 途径，可能起到一定的作用. 【关键词】穿孔素乙型肝炎病毒肾小球肾炎 0 引言 目前 HBV 病毒在 HBV 相关性肾小球肾炎（HBV relatedglomerulonephritis，HBV GN）发病中的作用愈来愈受倒大家的重视.杀伤性 T 细胞是乙肝发病过程中引起病理损伤的重要免疫活性细胞，穿孔素(perforin,PFP)是免疫活化细胞杀伤靶细胞的主要介质之一.研究发现 CD8CTL特异的细胞毒效应，由穿孔素介导，可以引起感染细胞损伤和死亡.如果在肾组织中发现 PFP 蛋白质水平的表达则能反映
3、活化免疫细胞与肾损害的关系，我们通过检测穿孔素在 HBV GN 肾组织中分布，初探穿孔素在 HBV GN 致病过程中的作用. 1 对象和方法 1.1 对象 所有病例均来自 2004 02/2004 11 在西安交通大学第一医院肾内科就诊的门诊和住院患者共 10（男 7，女 3）例，平均 27.5 岁.均经肾穿刺活检，确诊为2HBV GN 者.同时排除了继发性肾小球疾病的患者.HBV GN 的诊断标准如下：血清 HBV 标志物阳性；患肾小球肾炎，并除外狼疮性肾炎等继发性肾小球疾病；肾组织切片中可找到 HBV 抗原（必备条件）.此标准符合乙型肝炎病毒相关性肾炎座谈会纪要的标准.另取 5(男 3，女
4、 2)例正常对照肾组织，来自因组织配型不合不宜移植的供肾体. 1.2 试剂 鼠抗人 PFP 单克隆抗体为 NovocastraLaboratories 公司产品（产品编号：141002）.即用型第二代免疫组化 ElivisionTMPlus 广谱试剂盒和 DAB 均购自福建迈新生物技术公司. 1.3 免疫组化法(Elivision) 检测肾组织内 PFP 表达 4m 冰冻切片，吹干，PBS 冲洗 33min，3mL/L 双氧水室温下孵育 10min，PBS 冲洗 33min；2mL/L 羊血清处理切片，室温下 30min，吸取羊血清，分别加入抗体（PFP 稀释度 120），室温下孵育 1h，P
5、BS 冲洗35min；每切片加 50L 聚合物增强剂，室温下孵育 20min，PBS 冲洗 33min，吸干 PBS；加入抗，室温下孵育 30min；PBS 冲洗 33min；DAB 室温下显色 5-10min；苏木精复染核，脱水，透明，封固.阴性对照片用 PBS 代替抗. 1.4 结果判断 perforin 抗体阳性细胞表现为胞浆内棕黄色点状或环状分布，分为肾小球及肾小管间质区域，随机计算 5 个肾小球横切面内表达 perforin 的阳性细胞数然后取平均值，即为肾小球横切面平均阳性细胞数；在肾小管间质区域随机计算 5 个高倍镜视野(400)内表达 perforin 的阳性细胞数然后取平均值
6、，即为该区域平均阳性细胞数.阳性强度分为 03 级(分别评分 03 分).0：无细胞着色为阴性.1：0.25 细胞明显着色为弱阳性.2：0.250.5 为阳性.3：0.5 为强阳性.阴性对3照组织无上述阳性反应. 1.5 肾小管间质活动性指数 肾小管间质病理改变半定量积分参照 Austin2标准.肾小管间质病变包括：肾小管变性、坏死；肾间质炎症细胞浸润.以上病变根据范围及严重程度分别记03 分.按无、轻、中、重度记 0，1，2，3 分.无明显病变记 0 分，小灶性(0.25)记 1分，片灶性（0.25，0.5）记 2 分，弥漫性(0.5)记 3 分.肾小管间质活动性指数为（1）（2）项积分之和
7、.轻度肾小管间质病变为 12 分，中度肾小管间质病变为34 分，重度肾小管间质病变为 56 分. 统计学处理:数据采用 SPSS11.5 软件进行分析处理.免疫组化半定量所得数据以中位数和四分位数间距描述，等级分组资料采用秩和检验.P0.05 有统计学意义. 2 结果 Perforin 在正常的肾小球，肾小管及间质均无表达（图 1）.perforin 在 HBV GN的肾脏组织内 2/10 在肾小球表达，但阳性表达较弱，半定量分析以 01 分为主（图 2），3/10 在肾小管阳性表达（图 3），阳性表达半定量评分均为：2 分；7/10 在肾间质表达（图 4），棕黄色阳性颗粒主要表达在肾间质细胞
8、浆内，阳性表达半定量评分中位数为 2，四分位数间距为 0.Perforin 在肾小球与肾间质的表达差异有统计学意义(P=Elivision1000.014，P0.05).肾间质轻，中，重度兵病变间 Perforin 表达差异无统计学意义. 3 讨论 HBV GN 指临床上出现肾炎的表现，同时肾组织中找到乙型肝炎病毒抗原，并除外狼疮性肾炎等其他继发性因素的一类肾小球肾炎.目前 HBV 病毒在HBV GN 的发病中的作用愈来愈受倒大家的重视，冯江敏等3用原位核酸杂交4技术在 26 例肾活检组织中，发现 8 例 HBV DNA 阳性，并且发现阳性者可见肾小管上皮细胞浆内、肾小球内皮细胞、肾间质小动脉
9、壁平滑肌细胞浆及某些浸润的炎性细胞浆内均可见茶色粗颗粒沉积.从而进一步证明了肾组织上不仅有HBVAg，还有 HBVDNA 存在，而且揭示了 HBVDNA 可以存在于肾组织细胞浆内，这种浆形 HBVDNA 是单股 DNA，是 HBVDNA 复制过程中的中间产物，据此推测 HBVDNA 在肾脏有原位复制的可能.同时发现肾脏 HBVDNA 阳性的细胞周围 75%的病例伴大量细胞浸润，与阴性组相差显著，并可见成簇的肾小管上皮细胞变性坏死，提示 HBV 诱导了细胞免疫的发生. Chisari 等4用 HBV 基因转移小鼠模型作体内研究证明，HBV 特异性细胞毒性 T 细胞（CTL）在肝内是通过复合抗病毒
10、免疫反应途径清除肝内 HBV.穿孔素（PFP）是一种存在于 CTL 和 NK 细胞胞浆细胞毒颗粒中的糖蛋白5，是 CTL 杀伤靶细胞的主要毒性蛋白，CTL 介导的细胞毒作用之一就是通过穿孔素途径引起靶细胞的坏死.有研究发现：在慢性乙肝的肝损害中，穿孔素介导的杀伤性 T 细胞毒作用发挥了重要的作用6.细胞毒性 T 细胞(CTL)在慢性乙肝发病过程中能够引起病理损伤，细胞毒性 T 细胞(CTL)应答的广度和力度决定病毒感染短暂或持续、肝细胞损伤轻微或严重，而且 CD8CTL 特异的细胞毒效应，可由穿孔素介导，引起感染的细胞损伤和死亡7.马路等8发现 HBV MN 的患儿的肾间质存在局灶 CD4和
11、CD8阳性的细胞浸润.我们的研究发现中，perforin 的表达主要在 HBV GN 的肾间质，在肾小球及肾小管的表达较弱.肾间质的穿孔素的表达较肾小球强.以上的结果提示在 HBV GN 的肾小球，肾小管和间质中，存在着 CTL炎细胞的浸润.在 HBV GN 的发病过程中，CD8阳性的 CTL 介导的 perforin 途径，可能起到一定的作用.perforin 在 HBV GN 的肾间质损害过程中的作用，仍需5增加样本量后进一步的观察. 【参考文献】 1 RapaniJA，SmythMJFunctionalsignificanceoftheperforin/granzymecelldeath
12、pathway JNatRevImmunol，2002,2(10)：735-747. 2王均玉，李幼姬，叶任高，等68 例狼疮性肾炎的肾小管间质病变探讨J中华肾脏病杂志，1999,15：82-84. 3冯江敏，周希静，任青，等用原位核酸杂交技术探讨乙型肝炎病毒对肾组织的致病作用J中华肾脏病杂志，1995,11(2):107-109. 4 ChisariVHepatitisBvirustransgenicmice:insightsintothevirusandthediseaseJHepat ology，1995,22：1316-1325. 5 RochelN，CowanJADependence
13、ofthelyticactivityoftheN terminaldomainofhumanpe rforinonmembranelipidcompositionimplicationsforT cellself preservationJEurJB iochem，1997,249(1)：223-231. 6 CernyA，ChisariFV.PathogensisofchronichepatitisC:Immunologicalfeaturesofhepaticin juryandviralpersistenceJHepatology，1999,30(3)：595-601. 7骆抗先乙型肝炎基础和临床M2 版北京:人民卫生出版社，2001：152-153. 8马路，潘涛，杨琪，等小儿乙肝相关膜性肾病患者小管间质改变的研究J中国中西医结合肾病杂志，2003,4(3):159-160.
