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1、1穿孔素在乙肝相关性肾炎的表达及意义【摘要】目的:通过探测 PFP 在 HBV 相关性肾炎的肾组织的表达,以了解 PFP介导的细胞毒作用在 HBV GN 发病中的意义.方法:10 例 HBV GN 活检肾组织,冰冻切片采用免疫组化法(Elivision)的方法检测 HBV GN 肾活检组织中的perforin 的表达.结果:在 HBV GN 肾组织内 perforin 在 2/10 的肾小球表达,3/10在肾小管阳性表达,7/10 肾间质表达.Perforin 在肾小球与肾间质的表达差异有统计学意义(P=0.014,P0.05).肾间质病变轻,中,重度间得 Perforin 表达差异无统计学意
2、义(P0.05).结论:HBV GN 的发病过程中,CD8+CTL 介导的 perforin 途径,可能起到一定的作用. 【关键词】穿孔素乙型肝炎病毒肾小球肾炎 0 引言 目前 HBV 病毒在 HBV 相关性肾小球肾炎(HBV relatedglomerulonephritis,HBV GN)发病中的作用愈来愈受倒大家的重视.杀伤性 T 细胞是乙肝发病过程中引起病理损伤的重要免疫活性细胞,穿孔素(perforin,PFP)是免疫活化细胞杀伤靶细胞的主要介质之一.研究发现 CD8CTL特异的细胞毒效应,由穿孔素介导,可以引起感染细胞损伤和死亡.如果在肾组织中发现 PFP 蛋白质水平的表达则能反映
3、活化免疫细胞与肾损害的关系,我们通过检测穿孔素在 HBV GN 肾组织中分布,初探穿孔素在 HBV GN 致病过程中的作用. 1 对象和方法 1.1 对象 所有病例均来自 2004 02/2004 11 在西安交通大学第一医院肾内科就诊的门诊和住院患者共 10(男 7,女 3)例,平均 27.5 岁.均经肾穿刺活检,确诊为2HBV GN 者.同时排除了继发性肾小球疾病的患者.HBV GN 的诊断标准如下:血清 HBV 标志物阳性;患肾小球肾炎,并除外狼疮性肾炎等继发性肾小球疾病;肾组织切片中可找到 HBV 抗原(必备条件).此标准符合乙型肝炎病毒相关性肾炎座谈会纪要的标准.另取 5(男 3,女
4、 2)例正常对照肾组织,来自因组织配型不合不宜移植的供肾体. 1.2 试剂 鼠抗人 PFP 单克隆抗体为 NovocastraLaboratories 公司产品(产品编号:141002).即用型第二代免疫组化 ElivisionTMPlus 广谱试剂盒和 DAB 均购自福建迈新生物技术公司. 1.3 免疫组化法(Elivision) 检测肾组织内 PFP 表达 4m 冰冻切片,吹干,PBS 冲洗 33min,3mL/L 双氧水室温下孵育 10min,PBS 冲洗 33min;2mL/L 羊血清处理切片,室温下 30min,吸取羊血清,分别加入抗体(PFP 稀释度 120),室温下孵育 1h,P
5、BS 冲洗35min;每切片加 50L 聚合物增强剂,室温下孵育 20min,PBS 冲洗 33min,吸干 PBS;加入抗,室温下孵育 30min;PBS 冲洗 33min;DAB 室温下显色 5-10min;苏木精复染核,脱水,透明,封固.阴性对照片用 PBS 代替抗. 1.4 结果判断 perforin 抗体阳性细胞表现为胞浆内棕黄色点状或环状分布,分为肾小球及肾小管间质区域,随机计算 5 个肾小球横切面内表达 perforin 的阳性细胞数然后取平均值,即为肾小球横切面平均阳性细胞数;在肾小管间质区域随机计算 5 个高倍镜视野(400)内表达 perforin 的阳性细胞数然后取平均值
6、,即为该区域平均阳性细胞数.阳性强度分为 03 级(分别评分 03 分).0:无细胞着色为阴性.1:0.25 细胞明显着色为弱阳性.2:0.250.5 为阳性.3:0.5 为强阳性.阴性对3照组织无上述阳性反应. 1.5 肾小管间质活动性指数 肾小管间质病理改变半定量积分参照 Austin2标准.肾小管间质病变包括:肾小管变性、坏死;肾间质炎症细胞浸润.以上病变根据范围及严重程度分别记03 分.按无、轻、中、重度记 0,1,2,3 分.无明显病变记 0 分,小灶性(0.25)记 1分,片灶性(0.25,0.5)记 2 分,弥漫性(0.5)记 3 分.肾小管间质活动性指数为(1)(2)项积分之和
7、.轻度肾小管间质病变为 12 分,中度肾小管间质病变为34 分,重度肾小管间质病变为 56 分. 统计学处理:数据采用 SPSS11.5 软件进行分析处理.免疫组化半定量所得数据以中位数和四分位数间距描述,等级分组资料采用秩和检验.P0.05 有统计学意义. 2 结果 Perforin 在正常的肾小球,肾小管及间质均无表达(图 1).perforin 在 HBV GN的肾脏组织内 2/10 在肾小球表达,但阳性表达较弱,半定量分析以 01 分为主(图 2),3/10 在肾小管阳性表达(图 3),阳性表达半定量评分均为:2 分;7/10 在肾间质表达(图 4),棕黄色阳性颗粒主要表达在肾间质细胞
8、浆内,阳性表达半定量评分中位数为 2,四分位数间距为 0.Perforin 在肾小球与肾间质的表达差异有统计学意义(P=Elivision1000.014,P0.05).肾间质轻,中,重度兵病变间 Perforin 表达差异无统计学意义. 3 讨论 HBV GN 指临床上出现肾炎的表现,同时肾组织中找到乙型肝炎病毒抗原,并除外狼疮性肾炎等其他继发性因素的一类肾小球肾炎.目前 HBV 病毒在HBV GN 的发病中的作用愈来愈受倒大家的重视,冯江敏等3用原位核酸杂交4技术在 26 例肾活检组织中,发现 8 例 HBV DNA 阳性,并且发现阳性者可见肾小管上皮细胞浆内、肾小球内皮细胞、肾间质小动脉
9、壁平滑肌细胞浆及某些浸润的炎性细胞浆内均可见茶色粗颗粒沉积.从而进一步证明了肾组织上不仅有HBVAg,还有 HBVDNA 存在,而且揭示了 HBVDNA 可以存在于肾组织细胞浆内,这种浆形 HBVDNA 是单股 DNA,是 HBVDNA 复制过程中的中间产物,据此推测 HBVDNA 在肾脏有原位复制的可能.同时发现肾脏 HBVDNA 阳性的细胞周围 75%的病例伴大量细胞浸润,与阴性组相差显著,并可见成簇的肾小管上皮细胞变性坏死,提示 HBV 诱导了细胞免疫的发生. Chisari 等4用 HBV 基因转移小鼠模型作体内研究证明,HBV 特异性细胞毒性 T 细胞(CTL)在肝内是通过复合抗病毒
10、免疫反应途径清除肝内 HBV.穿孔素(PFP)是一种存在于 CTL 和 NK 细胞胞浆细胞毒颗粒中的糖蛋白5,是 CTL 杀伤靶细胞的主要毒性蛋白,CTL 介导的细胞毒作用之一就是通过穿孔素途径引起靶细胞的坏死.有研究发现:在慢性乙肝的肝损害中,穿孔素介导的杀伤性 T 细胞毒作用发挥了重要的作用6.细胞毒性 T 细胞(CTL)在慢性乙肝发病过程中能够引起病理损伤,细胞毒性 T 细胞(CTL)应答的广度和力度决定病毒感染短暂或持续、肝细胞损伤轻微或严重,而且 CD8CTL 特异的细胞毒效应,可由穿孔素介导,引起感染的细胞损伤和死亡7.马路等8发现 HBV MN 的患儿的肾间质存在局灶 CD4和
11、CD8阳性的细胞浸润.我们的研究发现中,perforin 的表达主要在 HBV GN 的肾间质,在肾小球及肾小管的表达较弱.肾间质的穿孔素的表达较肾小球强.以上的结果提示在 HBV GN 的肾小球,肾小管和间质中,存在着 CTL炎细胞的浸润.在 HBV GN 的发病过程中,CD8阳性的 CTL 介导的 perforin 途径,可能起到一定的作用.perforin 在 HBV GN 的肾间质损害过程中的作用,仍需5增加样本量后进一步的观察. 【参考文献】 1 RapaniJA,SmythMJFunctionalsignificanceoftheperforin/granzymecelldeath
12、pathway JNatRevImmunol,2002,2(10):735-747. 2王均玉,李幼姬,叶任高,等68 例狼疮性肾炎的肾小管间质病变探讨J中华肾脏病杂志,1999,15:82-84. 3冯江敏,周希静,任青,等用原位核酸杂交技术探讨乙型肝炎病毒对肾组织的致病作用J中华肾脏病杂志,1995,11(2):107-109. 4 ChisariVHepatitisBvirustransgenicmice:insightsintothevirusandthediseaseJHepat ology,1995,22:1316-1325. 5 RochelN,CowanJADependence
13、ofthelyticactivityoftheN terminaldomainofhumanpe rforinonmembranelipidcompositionimplicationsforT cellself preservationJEurJB iochem,1997,249(1):223-231. 6 CernyA,ChisariFV.PathogensisofchronichepatitisC:Immunologicalfeaturesofhepaticin juryandviralpersistenceJHepatology,1999,30(3):595-601. 7骆抗先乙型肝炎基础和临床M2 版北京:人民卫生出版社,2001:152-153. 8马路,潘涛,杨琪,等小儿乙肝相关膜性肾病患者小管间质改变的研究J中国中西医结合肾病杂志,2003,4(3):159-160.