《人骨髓间充质干细胞对K562细胞增殖和化疗敏感性的影响》由会员分享，可在线阅读，更多相关《人骨髓间充质干细胞对K562细胞增殖和化疗敏感性的影响（7页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1人骨髓间充质干细胞对 K562 细胞增殖和 化疗敏感性的影响作者：林玉梅，卜丽梅，杨少娟，高申，张桂珍 【摘要】 本研究比较 K562 细胞与正常人骨髓间充质干细胞（MSC）黏附培养前后细胞增殖、化疗敏感性及 MDR1 变化，以寻找白血病耐药与造血微环境的关系。对悬浮培养和与 MSC 黏附培养的 K562 细胞绘制细胞生长曲线；用流式细胞术测定细胞周期并观察化学药物对细胞存活率和凋亡的影响；用 RT-PCR 技术检测MDR1 基因表达。结果表明：与悬浮培养比较，黏附培养 K562 细胞增殖受抑，G0/G1 期细胞比例增加 (P0.05)，S 期细胞比例下降 (P0.05)，G2/M 期细胞比
2、例增加(P0.01)。在柔红霉素（DNR）诱导的凋亡中，黏附培养组 K562 细胞凋亡受阻 (P0.05)。黏附培养未诱导 K562 细胞 MDR1 基因表达，也未使K562/ADM 细胞的 MDR1 基因表达发生改变。结论： K562 细胞与 MSC 黏附接触共培养，可导致 K562 细胞生长抑制，并产生化疗耐药，其机制可能与 MDR1 无关。 【关键词】 骨髓间充质干细胞Influence of Human Mesenchymal Stem Cells on Cell Proliferation and Chemo- sensitivity of K562 CellsAbstract Th
3、is study was aimed to compare K562 cell proliferation，chemo- sensitivity and alteration of MDR1 before and after adhesive culture with MSC，so as to evaluate the relationship between chemodrug-resistance of leukemia cells and hemopoietic microenvironment. K562 cell cultivated in suspension and adhesi
4、vely cultivated with MSC were collected respectively and cell proliferation curves were drawn; the cell cycle was determined by flow cytometry; the effect of chemotherapy 2on cellular viability and apoptosis of K562 cell was investigated，the MDR1 gene expression was determined by RT-PCR. The results
5、 showed that K562 cells adhesively cultivated with MSC were inhibited and cells in G0/G1 increased (P0.05)，cells in S phase decreased (P0.05) and those in G0/G1 increased (P0.01)，compared with that cultivated in suspension.In process of daunomycin-inducing apoptosis，K562 cell apoptosis in the adhesi
6、ve culture with MSC was inhibited (P0.05).MDR1 gene expression in K562 cells was not induced or altered by adhesive co-cultivation.It is concluded that by co-culture of cell-cell contact with MSC，growth suppression and induction of chemo-resistance of K562 cells take place.The mechanism，however，seem
7、s not relevant with MDR1.Key words mesenchymal stem cell; K562; drug resistance; apoptosis; MDR1耐药是根治白血病的最主要障碍，其发生机制及逆转的研究一直是白血病的研究热点，以往人们主要集中在对单个白血病细胞本身的分子生物学改变的研究，并取得了显著成果，但在体内仍难克服耐药的发生。近年来，随着对骨髓造血微环境（hematopoietic microenviroment，HM）的认识不断加深，发现骨髓基质细胞在白血病细胞恶性克隆的增殖、分化和凋亡中起重要作用1。而骨髓基质细胞的前体细胞骨髓间充质干细胞（
8、mesenchymal stem cell，MSC）是骨髓造血微环境中基质细胞的主要来源，对正常造血也具有调控作用，但对白血病细胞的调节作用尚不清楚。本研究以人慢性髓细胞白血病 K562 细胞株为靶细胞，与正常人 MSC 共培养，观察其对 K562 细胞增殖和化疗敏感性的影响，以探讨 MSC 与白血病耐药的关系。材料和方法试剂柔红霉素、阿霉素（DNR、ADM)，均购自 Pharmacia 公司；DMEM-LG、RPMI 1640 培养液购自 Gibco 公司；FBS 购自 Hyclone 公司； RT-PCR 试剂盒、蛋白酶K、RNA 酶及琼脂糖均购自 Promega 公司； PCR 引物由上
9、海生物工程公司合成。TRIZOL 购自 Invitrogen 公司；Percoll(密度 1.073 g/ml)，购自 Amersham 3Biosciences 公司。碘化丙锭（PI）购自美国 Coulter-Immunotech 公司。人骨髓 MSC 的分离和培养骨髓 MSC 的分离、纯化和扩增按 Pittenger 等2报道的方法进行。取肝素抗凝健康自愿者骨髓液 5 ml，用 Percoll 分离液分离单个核细胞（MNC），以2.0105/cm2 细胞接种于 75 cm2 的 Nunc 培养瓶内，培养体系为含 10% FBS 的DMEM-LG，置于 37、5% CO2 饱和湿度的孵箱中进
10、行原代培养。培养 48 小时后换液，除去非贴壁细胞，以后每 3 天换液 1 次。待覆盖培养瓶底面积的 80%以上时加入 0.25%胰蛋白酶消化传代，按 5103/cm2 传代培养，每 3 天换液 1 次。2-4 代细胞用于实验。人骨髓 MSC 表面标志的鉴定将胰蛋白酶消化收获的 MSC 以 2105 个细胞分别与抗CD29、CD34、CD44、CD45、CD73、CD105、CD166、HLA-A/B/C 和 HLA-DR（PharMingen 公司）室温反应 30 分钟，经 PBS 洗涤 2 次后与标记 FITC 的二抗避光反应 15 分钟，细胞洗涤后悬浮于 PBS 中以备流式细胞仪分析。K
11、562 细胞与 MSC 黏附培养K562/ADM 细胞株，购于中国医学科学院血液学研究所，在 ADM 1.0 g/ml 的含 10% FCS 的 RPMI 1640 培养液中稳定生长。试验前 2 周换用无 ADM 的培养液培养。K562 细胞株由本医院中心研究室提供，培养体系同上。已传代的 MSC以 1104 /cm2 接种于 75 cm2 的培养瓶中，待细胞贴壁呈融合状态时在其上分别直接加入对数生长期的 K562 和 K562/ADM 细胞（1105/ml）。48 小时后先去除未4黏附的白血病细胞，根据文献报道方法3吹打收集黏附生长的白血病细胞。细胞生长曲线测定悬浮培养组取生长状态良好的 K
12、562 细胞接种于 24 孔培养板，每孔 1 ml，含 1104 细胞，每 3 天换液 1 次。黏附培养组已传代的 MSC 接种于 24 孔培养板，每孔 1 ml，含 1104 细胞，待 MSC 完全贴壁融合后，在其上直接加入悬浮生长的 K562 细胞 1104，体积同上。每组均 3 天换液 1 次。在第 1 至 8 天分别收集各组 K562 细胞，台盼蓝染色记数活细胞数，每组有 3 个平行孔，取均值。最后以培养时间为横坐标，细胞数为纵坐标绘制生长曲线。细胞周期的流式细胞术（FCM）测定分别取悬浮培养和黏附培养 48 小时的 K562 细胞 2106，用冷 PBS 洗 2 次，加入预冷 70%
13、乙醇固定，4过夜，RNase 处理 30 分钟后离心，PI 染色 30 分钟，用流式细胞仪检测。每组实验重复 3 次，取均数。黏附培养对 K562 细胞药物敏感性的影响MSC 接种于 24 孔培养板，分 2 组。待细胞贴壁呈融合生长状态时，在其上直5接加入悬浮生长的 U937 细胞，48 小时后计数 1 组 K562 细胞数。另 1 组与相同细胞数的悬浮培养组平行加入含不同浓度 DNR（0.1-3.2 g/ml）的培养液，于 24 小时收集白血病细胞，通过台盼蓝排斥实验检测细胞活率。每组 3 个平行孔，取均数。细胞凋亡的 FCM 检测不同浓度的 DNR 作用 24 小时后，分别收集悬浮和黏附培
14、养组 K562 细胞 2106，方法同细胞周期检测，出现亚 G1 峰的细胞为凋亡细胞，获得凋亡率。每组实验重复 3 次，取均数。 DNA 片段的琼脂糖凝胶电泳检测不同浓度的 DNR 作用 24 小时后，分别收集悬浮和黏附培养组 K562 细胞 2106，加细胞裂解缓冲液（1 mmol/L tris-HCl，pH 8.0，10 mmol/L EDTA，pH 8.0，200 mg/L 蛋白酶 K，0.5% SDS），在 50保温 3 小时，使细胞充分裂解，酚氯仿抽提 DNA，在抽提液中加 1/10 体积的 2 mol/L naAc 和 2 倍体积的乙醇，使DNA 沉淀，-20过夜。4、1 000g
15、 离心，DNA 沉淀用 TE 缓冲液溶解，加入RNA 酶 200 mg/L，37保温 1 小时，2%琼脂糖凝胶电泳 2 小时，观察 DNA ladder形成。MDR1 基因表达的 RT-PCR 测定MDR1 上游引物：5-CCC ATC ATT GCA ATA GCA GG-3；下游引物：5-GTT CAA ACT TCT GCT CCT GA-3，扩增片段 157 bp。以 -actin 作为内参照（扩增片段 418 bp）。用 TRIZOL 抽提总 RNA，RT-PCR 参照试剂盒说明书操作，反应条件：45逆转录 45 分钟，94 AMV RT 灭活和 RNA/cDNA 引物变性 2 分钟
16、。循环参数：94 30 秒，60 1 分钟，68 2 分钟，40 个循环后 68再延伸 7 分钟。取扩增6产物进行 2%琼脂糖凝胶电泳。统计学处理应用 SPSS 10.0 软件分析结果，率的比较用 2 检验，两样本间均数比较用 t 检验。结 果MSC 的生长特点及免疫表型特征分离的骨髓单个核细胞于接种 24 小时时即可见大量贴壁略伸展的细胞，72 小时后出现典型的纺锤细胞，4 天左右形成克隆。MSC 贴壁稀疏时，长梭形细胞的两极朝向不规律，细胞排列混乱，细胞之间往往通过突起相连接。近 3 周时出现致密的细胞层，细胞两极有规律的排列成束状或旋涡状。传代后 MSC 生长迅速，近10 天时细胞即可融合。用流式细胞仪分析了 MSC 的表面抗原标记。结果显示，MSC 表达 CD29、CD44、CD73、CD105、CD166、HLA-A/B/C，而CD34、CD45、HLA-DR 则呈阴性。MSC 对 K562 细胞增殖动力学的影响K562 细胞与 MSC 黏附培养 8 天后，从细胞生长曲线可
