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1、1共振光散射技术在药物分析中的应用【摘要】 对共振光散射技术在药物与生物大分子分析测定中的应用状况及其进展进行了综述。重点介绍了该方法在生物体液中药物的分析和中药成分的分析应用前景。为体内大分子药物及其他药物成分的检测方法研究提供了新途径。 【关键词】 共振光散射技术; 药物分析Abstract:The application and the development of the resonance light scattering (RLS) method used in drug determination and the biomacromolecule determination wa
2、s reviewed. The application of RLS in pharmaceutical quantification in biological fluids,and the application of RLS in quantification of Chinese medicine were reviewed. This method might be a novel way for the determination macromolecular drugs and other medicinal ingredients in vivo.Key words:reson
3、ance light scattering; pharmaceutical quantification共振光散射(resonance light scattering，RLS)是利用普通荧光分光光度法对散射光进行测量的一种散射光分析技术1。该技术由于其简单、快速、灵敏的分析特点，吸引了生命科学、分析化学、环境科学、材料科学等领域的分析工作者对其理论和应用进行了深入的研究，促进了分析学科内部各个分支之间的联系，尤其是在生化领域已经取得一定的研究成果2。光散射现象广泛存在于光与粒子相互作用的过程中，当介质中粒子的直径(d)与入射光波长(0)存在 d0.05 0 时，产生的是以瑞利(Rayleig
4、h)散射为主的分子散射光3。根据 RLS 理论可以得到散射光强度与散射粒子的浓度 c 成正比的关系，即 IRLS=Kcb。据此可以用于大分子物质溶液的分析测定1。2RLS 分析法灵敏度高，操作简单方便，可通过普通荧光分光光度计同步扫描得到完整的 RLS 特征光谱和相应 RLS 峰。由于 RLS 法源于 Rayleigh 散射光吸收光谱，它对分子结构大小和形状(如球形、链形、无规则线团等)、电荷分布、键合性质等研究还能提供新的、更丰富的信息。近年来的研究证明，RLS 法还可用于痕量金属、表面活性剂以及纳米材料4,5等方面的研究测定。该方法一般不需要对样品进行复杂的化学预处理，避免了一系列烦琐的操
5、作程序，而直接将处理好的样品溶液置于普通的荧光分光光度计中进行测定即可。1 体液中生物大分子的测定1.1 蛋白质蛋白质的功能很多，与生命的起源和生物的进化、细胞结构、病毒、免疫、酶、激素、物质的遗传等有密切的联系，它是生命现象的物质基础。蛋白质定量测定是生物化学和生命学科中经常涉及的分析内容，在临床医学中也有重要应用。目前，蛋白质测定方法主要有 Lowry 法6，Bradford 法7，Biuret 法8，Bromoeersol Green 法9与 Bormophenol blue 法10等。Pasetmack1将 RLS 技术用于测定微量蛋白质以来，RLS 法分析技术以其方法简单、快速、灵敏
6、度高，在生物大分子分析测定研究中的报道日益增多，灵敏度可达纳克级11。黄承志等研究了阴离子表面活性剂罗丹明 B(Rhodamine B，RhB)与十二烷基硫酸钠(SDS) 蛋白质体系的 RLS 光谱特征。实验发现，SDS 与 HSA(human serum albumin，HSA)结合后再与 RhB 作用，其散射光强度增强。且 RLS 增强的程度与蛋白的浓度在一定范围内呈线性关系。据此，建立了一种测定人血清中总3蛋白质的新方法 12。胡之德等基于在 pH2.11 的酸性溶液中，聚乙二醇辛基苯基醚(OP)对亮丽春红 5R 蛋白质体系的 RLS 信号有强烈的增敏现象，建立了 OP 蛋白质 亮丽春红
7、 5R 三元体系测定人血清中蛋白质浓度的新方法。该体系对人血清白蛋白检测的线性范围在 0.010.0 pgmL-1 之间，检测限为 5.0 ngmL-1，检测实际样品的回收率在 97.80%109.62%之间，方法令人满意13。王锡宁等利用 RLS 技术测定白蛋白、红蛋白。研究了间苯二酚黄 OP 蛋白质体系 RLS 光谱特性，确定了在 340.0 nm 处，pH2.40，间苯二酚黄浓度为 2.310-5 molL-1，OP 的浓度为 3.010-5 molL-1 时为最佳反应条件，据此建立了一种灵敏度高的测定蛋白质的新方法14。薛蓓等研究了流动注射(FIA) RLS 技术联用在线测定人血清中蛋
8、白质含量。以 SDS 为荧光探针，利用未曾报道过的 RLS 与 FIA 联用检测人血清样品中蛋白质含量。与单纯用 RLS 法测定比较，分析时间由 40 min 缩短至 1 min，RLS 信号的重现性得到了显著改善，提高了实验的灵敏度和重现性15。梁宏等在普通荧光分光光度计上选择合适的激发光和发射光通带宽度，利用 RLS 技术，研究了生理 pH 值(7.430.02)，25 下，金()与血清白蛋白的相互作用。首次观测到金()对血清白蛋白的 RLS 强度随着金()浓度增加而降低。结果表明，金()与血清白蛋白的结合会破坏血清白蛋白分子聚集，使血清白蛋白中的二硫桥键断裂，导致白蛋白分子趋于松散，散射
9、截面积减小，表现为 RLS 强度降低16。1.2 核酸核酸是遗传信息的载体和基因表达的物质基础，在生物的生长、发育等活动中具有十分重要的作用。目前核酸分析测定的方法主要有分光光度法、荧光光度法、化学发光法、探针技术法、免疫分析法等，其中分光光度法17和荧光光度法18使用较多。紫外分光光度法操作简单，但由于灵敏度低，测定的干扰因素多，使其4在应用上受到了限制;荧光分析法具有选择性好和灵敏度高，但荧光试剂价格昂贵，而且部分荧光试剂有致癌活性。针对上述情况，RLS 法因操作简便快速，灵敏度高，试剂无毒性等优势，在核酸分析中也得到了广泛的应用。黄承志等利用溴化十六烷基三甲铵(cetyltrime th
10、ylammonsium bromide,CTMAB)是阳离子表面活性剂，核酸因带有大量的磷酸根而带负电荷的特性，证明了 CTMAB 和核酸通过静电引力共吸附到液/液界面上形成两性复合物，导致强烈增加的全内反射共振光散射(total internal reflected resonance light scattering，TIR RLS)信号，TIR RLS 信号强度与核酸的浓度呈线性19。刘绍璞等研究了 5 种阳离子表面活性剂与核酸反应的 RLS 光谱20。陈展光等首次利用诺氟沙星做为 RLS 光谱探针，测定了叶绿体脱氧核糖核酸(ctDNA)。在 pH5.87 的BR(Britton Rob
11、inson)缓冲溶液中，波长 405.5 nm 处出现最大 RLS 峰，ctDNA 的线性响应范围为 0.022.30 gmL-1，检测限为 1.2 ngmL-1。还合成了希夫碱试剂三 (2 (邻羟基苯基亚甲氨基)乙基)胺，并且研究了其与核酸在盐酸介质中的反应。对希夫碱剂三 (2 (邻羟基苯基亚甲氨基)乙基)胺 DNA 体系的研究发现，在 393.0nm 处增加的 RLS 强度与核酸的浓度成线性关系(ctDNA，0.014.50 gmL-1;fsDNA，0.015.00 gmL-1)。ctDNA 的检测限是 1.4 ngmL-1，fsDNA的检测限是 2.1 ngmL-1。结果与紫外 可见分光
12、光度法测得结果一致 21。林枫等研究在 pH4.0 介质中加入 DNA 和阳离子表面活性剂可使二甲酚橙的 RLS 增强，据此建立了以二甲酚橙为分子探针测定 DNA 的分析方法，适用于合成样品中的DNA 测定22。2 在化学药分析中的应用5黄承志等利用具有双亲性的 RhB CTMAB 全内反射共振光散射法测定肝素，肝素通过与 RhB 和 CTMAB 相互作用形成三元双亲性的复合物 RhB 肝素CTMAB，而被 RhB 和 CTMAB 协同吸附在水/四氯化碳(H2O/CCl4)界面上，引起强烈的 TIR RLS 增强信号用于肝素的测定19。陈展光等在氧氟沙星 茜素紫 3B 体系中发现，pH5.09
13、 的 BR 缓冲溶液中，在 439.5 nm 处，0.102.50 gmL-1 范围内的氧氟沙星与增加的 RLS 强度成线性关系。与此同时，在 pH6.90，405.0 nm 处，0.053.00 gmL-1 范围内的氧氟沙星与 RLS 强度成线性关系，检测限分别为 0.013 gmL-1，0.021 gmL-121。氧氟沙星 茜素紫 3B 体系可用于人体的氧氟沙星血药浓度测定。还建立了人血清中抗菌类四季铵化合物的 RLS 技术检测方法23。陈展光等，建立的二溴羟基苯基荧光酮(DBHPF) 曲通(Triton)X 100 钼的共振光散射光谱新体系，分析测定了中药、头发以及水中的微量钼21。刘云
14、富等研究发现在硫酸介质中，砷钼杂多酸与碱性染料 RhB 缔合导致 RhB 体系的RLS 强度减弱，在一定浓度范围内，砷()的含量与体系减弱的 RLS 强度成线性关系，据此建立了 RLS 技术测定砷()的新方法24。3 在中药分析中的应用黄承志等，研究了荧光素(Flu) 小檗碱(BE)全内反射共振光散射法测定小檗碱。采用 TIR RLS 技术通过 Flu 与 BE 在水/1,2,二氯乙烷(H2O/DCE)界面反应研究了 BE 在界面上的特性。Flu 与 BE 形成双亲性的复合物，在 H2O/DCE 界面富集，并引起强烈增加的 TIR RLS 信号，最大吸收波长位于 373.0 nm，所得信号强度
15、在一定范围内与 BE 浓度成正比关系，检测限为 1.3 ngmL-1。本方法与药典使用的 HPLC 方法对照灵敏度有所提高 19。张忆华等，在 pH 为 10.0 的 Tris 缓冲溶6液中建立了绿原酸 CTMAB ctDNA 体系，实验表明，440.0 nm 处增强的 RLS 光强度(IRLS)稳定，在 0.0020.10gmL-1 的浓度范围内，体系 IRLS 与 ctDNA的浓度具有良好的线性关系，检测限为 0.6 ngmL-1。在厚朴酚 CTMAB ctDNA体系中，选择 pH 值为 10.0 的 Tris 缓冲溶液来控制反应体系的酸度，356.0 nm 作为定量分析的波长。在 0.0
16、21.00 gmL-1 的浓度范围内，IRLS 与 ctDNA 的浓度具有良好的线性关系。在最佳反应条件，320.0 nm 处，pH10.0 时，儿茶素CTMAB ctDNA 体系在 0.021.00 gmL-1 的浓度范围内，IRLS 与 ctDNA的浓度成线性关系。类似的实验还有山柰酚 CTMAB ctDNA 体系。此外，张忆华还研究了三价稀土离子与槲皮素、山柰酚所形成的络合物的 RLS 光谱，研究了ctDNA 对它的淬灭作用。建立了 Tb3+/Eu3+ 槲皮素 ctDNA 体系以及Tb3+/Eu3+ 山柰酚 ctDNA 体系，结果表明，槲皮素与山柰酚通过配位作用与Tb3+/Eu3+结合，引起体系 RLS 光强度的增加，而当加入 ctDNA 后，体系的 RLS光强度降低，原因是 ctDNA 结构中的磷酸骨架可以与 Tb3+和 Eu3+发生螯合作用
