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1、1三氯化铝比色法测定中药总黄酮方法的 探讨作者：马陶陶 张群林 李俊 孟晓明 黄成 陈玉璞【摘要】 目的探讨以芦丁作为对照品，采用三氯化铝（ ）比色法测定中药总黄酮含量的专属性，并建立比色法测定中药总黄酮含量的最优条件。方法通过对几类典型结构的黄酮类及多酚类化合物显色前后的吸收峰（ ）进行比较，分析以芦丁为对照品的 比色法测定中药总黄酮的合理性。结果 显色后，部分黄酮类物质在 处有较强吸收。结论采用 比色法测定中药总黄酮的含量具有合理性，并建立了 比色法测定中药总黄酮含量的最优条件。 【关键词】 比色法 总黄酮 芦丁Abstract：Objective on MethodsTo m struc
2、ture measure Results ， flavonoid-like compounds showed Conclusion the Key words： c； ； 黄酮类化合物（）是以 结构为基本母核的色原烷或色原酮的衍生物，以其广泛的药理作用倍受青睐，而中药材中总黄酮的含量测定成为近年来研究黄酮化合物所关注的焦点。中药总黄酮的含量测定一般采用比2色法、高效液相色谱法等 。比色法是被中国药典所采用的最常见的总黄酮测定方法，其中又以 （ ） 比色法常用 。这种方法以 （ ） 为显色剂，在碱性条件下，利用其与黄酮物质生成红色铝螯合物为特征，以芦丁为对照，在 处测定吸光度，从而得到待测物质总
3、黄酮的含量。郭亚建等 曾对这种方法的专属性进行了讨论，发现具有邻二酚羟基的非黄酮类物质在芦丁显色的最大波长处（ 左右）也有较强吸收，而黄酮类成分黄芩素、山柰酚在此波长处没有吸收，从而说明采用 （ ） 比色法，以芦丁作为对照，不能排除非黄酮类物质的干扰，这种方法测定中药总黄酮含量的专属性不强。因此，本实验采用另一种常用的比色法： 比色法，对几类典型结构的黄酮类化合物（芦丁、儿茶素、木犀草素、鼠李素、山柰奈酚、槲皮素、葛根素、金丝桃苷、橙皮苷）及多酚类化合物（， 二羟基苯甲酸，绿原酸，和厚朴酚，阿魏酸） 显色前后的吸收峰（ ）进行比较，分析以芦丁为对照品的 比色法测定中药总黄酮的合理性，并对芦丁显
4、色的 值， 浓度、显色温度等条件进行优化研究。1 仪器与试药 紫外分光光度计； 精密 计（上海雷磁仪器厂）。试剂：芦丁，葛根素， 二羟基苯甲酸，绿原酸，和厚朴酚，阿魏酸，儿茶素，木犀草素，异鼠李素，山柰奈酚，槲皮素，金丝桃苷，蒙花苷、橙皮苷均购自中国药品生物制品检定所。三氯化铝，醋酸钠，冰醋酸，甲醇均为分析纯，水为双蒸3水。2 方法2.1 供试品的制备以芦丁为例，精密称取芦丁标准品（ 烘干至恒重） ，甲醇定容至 ，配成 的芦丁母液。2.2 显色试剂的配置精密称取 ，甲醇定容至，配成 的溶液。精密称取 ，双蒸水溶解至 ，配成 的溶液。精密量取 冰醋酸， 双蒸水稀释至 配成 的醋酸溶液， 。2.3
5、 芦丁紫外吸收峰的扫描精密量取 芦丁母液溶液，置于 容量瓶，加入 的 溶液，甲醇定容，充分显色 ，在 范围扫描，记录吸光度值。2.4 供试品紫外吸收峰的扫描精密量取 供试品（芦丁，葛根素， 二羟基苯甲酸、绿原酸、阿魏酸、和厚朴酚、儿茶素、木犀草素、异鼠李素、山柰奈酚、槲皮素、金丝桃苷、蒙花苷、橙皮苷），按“” 项下方法，在 扫描样品的紫外吸收峰。2.5 标准曲线及可行性考察从芦丁母液中精密移取， 溶液，平行两份，第 份直接加入 的 显色 ；第 份加入 ， 为 的 缓冲溶液，水浴显色 ，分别做标准曲线，并以金丝桃苷为样品，考察方法的可行性。3 结果43.1 芦丁显色的紫外光谱图在黄酮类化合物的紫
6、外光谱图上，主要有苯甲酰基部分引起的吸收带 （ ）和桂皮酰基部分引起的吸收带 （ ），加人铝盐可使黄酮类化合物与铝离子形成稳定的络合物，带 红移，吸光度明显增大。当加入 充分显色后，芦丁吸收峰从 红移至 ，且吸光度有所增加。见图。图 芦丁加入 前后的紫外光谱图（略）3.2 比色法专属性探讨在 对几种典型结构的黄酮类物质及多酚类物质 显色前后的紫外吸收峰进行比较，结果发现显色后金丝桃苷、异鼠李素、山柰奈酚的吸收峰位置和芦丁的相似，都在 左右，而其他物质的与芦丁的不同。如图 为显色后各物质的紫外光谱图。 图 种物质显色后的紫外光谱图（略）3.3 显色条件的优化3.3.1 值的影响采用 缓冲盐溶液调
7、节溶液的 值，实验表明，当缓冲盐的 值小于 时，芦丁的吸收峰在 左右，且吸光度值较小；当 值在 时，吸收峰在 左右，吸光度值增大，如图（）。且当 值为时，吸光度值最大，因此选择 为 的 缓冲盐体系作为优化的显色条件之一。3.3.2 的浓度以 的芦丁溶液， 值的 缓冲盐为条件，在 范围内讨论 浓度对芦丁吸收峰的位置及吸光度大小的影响，结果发现： n 芦丁：5 时，即 浓度为 时，吸收峰在 左右，且吸光度的值随 浓度的增加而变大。如图（）所示。n 芦丁： ：，即浓度小于 时，吸收峰在 左右，且吸光度减小。n 芦丁：，即 浓度大于 ，吸收峰移至 左右，且吸光度减小。因此选择 浓度为 为芦丁显色的优化
8、条件之一。3.3.3 显色温度对吸光度的影响实验中由于显色时间较长，为了提高效率，采用水浴加热。加热 ，考察水浴温度对吸收峰位置及吸光度大小的影响。如图（）。结果表明，水浴温度是芦丁显色的优化条件之一。图 显色条件对芦丁吸光度的影响（略）3.4 显色稳定性考察以 芦丁溶液， ， 值 缓冲溶液为条件，考察显色的稳定性，结果表明，显色 ，吸光度变化的 RSD 为，说明以芦丁为对照，比色法显色稳定。3.5 线性及可行性考察以一定浓度的金丝桃苷作为样品，直接加入 的 ，显色 ，其标准方程：Y X，R ，测得的金丝桃苷的浓度是 ，回收率为；而优化后的方法： ， 为 的 缓冲溶液，水浴显色 ， 其线性方程
9、为 Y X，R ，测得的金丝6桃苷浓度为 ，回收率为。由此说明 ， 的 缓冲盐溶液，水浴显色 ，方法的准确度更高，为 比色法的优化方法。4 讨论葛根素、蒙花苷、橙皮苷加入 ，反应前后紫外吸收峰的位置没有发生改变，而其余物质的紫外吸收峰均发生红移。从结构上分析，葛根素、蒙花苷、橙皮苷只存在 位羟基，不存在邻二酚羟基和 位羟基，由此可见 的显色反应主要发生在 位羟基、 位羰基和邻二酚羟基，只存在 位羟基、 位羰基时黄酮类物质与 不发生反应。芦丁与 发生显色反应，生成黄色络合物，在 左右有较强吸收。实验对几种常见的多酚类化合物紫外光谱图进行了扫描，结果表明对于含邻二酚羟基的非黄酮化合物：， 二羟基苯
10、甲酸、阿魏酸、和厚朴酚、绿原酸， 显色前后在 左右均没有吸收峰，消除了非黄酮类化合物对显色的干扰。槲皮素为芦丁的苷元，显色后在 左右有较大吸收，而芦丁的最大吸收峰在 ，说明黄酮的苷和苷元的极性相差较大，槲皮素 位羟基可能对反应有影响。木犀草素的结构和芦丁相比， 位没有羟基，显色后在 有最大吸收，从而进一步说明 位羟基可能对 显色反应有影响。具有典型结构的常见的黄酮类苷和苷元：金丝桃苷，芦丁，异鼠李素，山柰奈酚， 显色前在 处无吸收，显色后均在芦丁的最大吸收峰 左右有较大的吸收。在现今的实验条件下，对于大多数黄酮类中药材而言，7多含有黄酮苷，常见的苷在此波长处有较强吸收，而非黄酮类物质在此处无吸收。因此以芦丁作为对照，比色法可以成为测定中药总黄酮含量的理想方法。对于任一络合反应，溶液的酸碱度会影响金属离子的水解及存在形式，影响络合物的组成。当采用盐酸（氢氧化钠）调节显色溶液 值时，因其酸（碱）性较强，破坏络合物的结构，无法测得中药总黄酮含量的真实值，而采用 缓冲盐溶液时，加入前后芦丁的吸收峰位置不变，仍在 处，所以采用 缓冲盐调节显色溶液的 值。从方法的可行性考察结果可
