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1、1Lipstatin 高产菌株筛选【摘要】 以毒三素链霉菌 XC-lp-2 的变株 OT-3 为出发菌株，经 UV 和微波复合诱变处理，并在含豆油的平板上定向筛选耐豆油突变株，获得了高产突变株 XC-lp-69，其 lipstatin 发酵效价达到 911g/ml，较出发菌株 OT-3 提高了 71.6%。传代试验表明突变株 XC-lp-69 的高产遗传特性稳定。 【关键词】 Lipstatin； 菌种选育； 诱变； 毒三素链霉菌ABSTRACT After Stretomyces toxytricini OT-3 was treated by UV and microwave irradia
2、tion, the soybean oil tolerant mutants were screened and a high-titre strain XC- lp-69 was obtained. The productivity of strain XC-lp-69 reached 911 g/ml, which is 71.6% more than that of the starting stain OT-3. The subculture experiments indicated that the hereditary character of high productivity
3、 of strain XC-lp-69 is stable.KEY WORDS Lipstatin; Strain breeding; Induced mutation; Streptomyces toxytricini收稿日期：2006-11-29作者简介：韩俊茹，女，生于 1966 年，女，硕士。研究方向：生物制药。Lipstatin(利普司他汀)是毒三素链霉菌(Stretomyces toxytricini)的代谢产物，能选择性抑制胃肠道中胰脂肪酶的活性，减少脂肪的分解和吸收，其四氢衍生物奥利司他(orlistat)已被 Roche 公司开发为减肥药(商品名：赛尼可，Xenical)1，
4、2，是目前唯一一个作为非中枢神经系统作用上市的治疗肥胖症的药物3。因此，发酵法生产 lipstatin 备受关注。提高 lipstatin 的发酵生产水平主要依赖于菌种选育和发酵工艺(培养基和培养条件)的优化这两个相辅相成的环节。本文采用紫外线照射和微波交替处理，并结合豆油耐受性菌株的理性化筛选，选育 lipstatin 高产菌株，获得了高产突变株 XC-2lp-69，发酵水平较原始菌株(XC-lp-2)提高了 2 倍多，且该菌株经多次传代后高产特性稳定性较好。1 材料与方法1.1 菌种毒三素链霉菌(Stretomyces toxytricini)XC-lp-2 由浙江医药股份有限公司新昌制药
5、厂提供， 发酵效价 300g/ml 左右。1.2 培养基(1)斜面及分离平板培养基(g/L) 可溶性淀粉 10.0，蛋白胨 5.0，KNO3 2.0，NaCl 2.0，KH2PO4 2.0，琼脂 20.0，去离子水配制，pH6.87.0。(2)摇瓶种子培养基(g/L) 冷榨黄豆饼粉 15.0，甘油 15.0，酵母膏 7.5，豆油5.0，KNO3 2.0，MgSO47H2O 1.0，自来水配制，pH7.07.2。(3)发酵培养基(g/L) 冷榨黄豆饼粉 30.0，甘油 20.0，大豆卵磷脂 12.0，酵母粉10.0，豆油 5.5，自来水配制，pH7.07.2。1.3 培养条件(1)斜面培养条件
6、培养温度(300.5)，相对湿度 35%50%，培养时间120150h。(2)种子培养条件 培养温度 27，250ml 三角瓶装量 25ml，转速 240r/min，培养时间 2024h。(3)发酵培养条件 培养温度 27，250ml 三角瓶装量 25ml，转速 240r/min，培养时间 120h。1.4 诱变处理3(1)紫外线照射 将单孢子悬浮液置紫外诱变箱(紫外灯功率 30W，波长 253nm 照射垂直距离 30cm)中诱变处理一定时间，用黑布包好，在红灯下用无菌水做梯度稀释后涂布平板，30避光培养 56d，挑单菌落传斜面。(2)微波处理 将单孢子悬浮液置于灭菌 10ml 试管中，在 5
7、00ml 烧杯中冰浴；然后将冰浴烧杯连同试管放入 800W 的微波炉中，功率开至中档，照射一定时间，经梯度稀释后涂布平板，30培养 56d，待菌落成熟后挑单菌落传斜面。1.5 耐豆油突变株筛选将经过 UV 照射、微波处理或两者交替处理后得到的孢子悬液梯度稀释后，分别涂布于含一定豆油浓度的分离平板上，30培养。1.6 分析方法(1)Lipstatin 发酵效价测定试样制备 取发酵液 10ml，4000r/min 离心 15min，上清液用丙酮 14 的比例稀释摇匀浸泡 1h，取上清液再次 10000r/min 离心 3min 或膜过滤，取清液进行 HPLC测定胞外效价，并用同样的方法测定菌丝体沉
8、淀中的产物量(胞内效价)。本文中发酵效价为胞内外效价之和。HPLC 色谱条件 色谱柱 C18 ODS(4.6mm250mm，5m)，柱温 35，检测器DAD(HP1100)，检测波长 210nm，流动相为乙腈水(8614)，流速 0.8ml/min。(2)pH 测定 用酸度计测定。4(3)菌丝浓度测定 取 10ml 发酵液，4000r/min 离心 15min，测定沉淀物在发酵液中所占比例作为菌丝浓度。 2 结果与讨论2.1 出发菌株的选择取 4冰箱保存的 10 株菌(XC-lp-2 经多次自然分离或其他诱变处理，经不同模型选择的较优菌株)，连续发酵三批，其结果平均值见表 1。由表 1 可以看
9、出 OT-3 菌株 lipstatin 发酵效价较高，因此选择 OT-3 为出发菌株。2.2 紫外线诱变处理结果试验中对出发菌株 OT-3 进行不同剂量的 UV 诱变处理，经梯度稀释后涂布平板，待菌落生长成熟后，从每个处理剂量平板中挑取 30 个单菌落分别传斜面，逐一接种发酵瓶，考察诱变株的发酵水平，统计其致死率、变异率(10%以上)和正变率，所得结果见表 2。由表 2 可知，随紫外线照射时间的延长，致死率、变异率相应增加，但正变率较高出现在偏低剂量(60s)，这与有关报道4一致，故后续试验中均采用 UV 照射60s。经多次 UV 诱变选得菌株 OT-63，较出发菌株 OT-3 效价提高 20
10、%，达到636g/ml。2.3 微波诱变处理结果试验中对出发菌株进行了不同时间的微波照射处理，稀释涂平板，待菌落成熟后转接斜面，摇瓶发酵考察。统计致死率、正突变率和产量的最大提高率，结果见表53。由表 3 可以看出，随着微波照射时间的延长致死率上升，正变率下降，但产量最大提高率随时间延长而上升，故后续试验采取微波照射 7min。以 OT-63 为出发菌株，进行微波诱变，微波处理后的孢子悬浮液经适当稀释后涂布于分离平板，待菌落成熟后，挑单菌落传斜面，进行摇瓶发酵初筛和复筛。得到高产菌株 W-39，总发酵效价和胞外发酵效价均高于菌株 OT-63，结果见图 1、图2。从图 1、图 2 可以看出，OT
11、-63 培养至发酵结束时(5d)分泌至胞外的 lipstatin 只有 35%，而 W-39 达 50%，比原来提高了 15%，且总的发酵效价也提高了 18%。推测微波的作用改变了菌体细胞膜的通透性，促进了胞内 lipstatin 的外排， 减轻了 lipstatin 对其自身表 1 冰箱保存菌株产生 lipstatin 的情况表 2 不同 UV 剂量诱变处理结果(表 3 不同时间微波处理结果生物合成途径的反馈调节作用，促进lipstatin 的合成。2.4 耐豆油突变株筛选文献报道，豆油为 lipstatin 的合成提供前体5，6。通过选育耐豆油突变株，能充分利用培养基中的豆油合成大量前体物
12、质参与 lipstatin 的生物合成，大幅度提高产量。以 OT-63 的单孢子悬浮液经适当稀释后，涂布于含不同浓度豆油的分离平板上，培养观察，结果如表 4。从表 4 可以看出，当豆油浓度为 1.5%(V/V)时，lipstatin 产生菌的生长受到严重的抑制，同时发现随着豆油浓度的增加，培养皿中菌落的生长速度也随之变慢，且6菌落变小。确定 1.5%(V/V)剂量进行耐受突变株的筛选，进一步对耐豆油变株的生产能力进行了统计分析，其产量分布结果见图 3。从图 3 可以观察到耐豆油突变株中，lipstatin 合成能力高于出发菌株的占 42%，低于出发菌株的占 10%，与出发菌株持平的占 48%。
13、如此高的正变率，说明了此筛选方法的合理性。表 4 不同浓度豆油对 lipstatin 产生菌生长的影响图 3 耐豆油变株产量分布图耐受剂量 1.5%(V/V) 经过 5 轮 UV 和微波交替处理，高浓度豆油平板选择，得到菌株 XC-lp-69 发酵效价达 911g/ml，较原始菌株XC-lp-2(300g/ml)提高了 2 倍多。推测这种诱变和筛选方法有助于提高菌体的脂肪酶的合成能力或活性，或提高脂肪酶的分泌速度，增加 lipstatin 合成所需前体浓度，提高 lipstatin 的效价。2.5 高产菌株 XC-lp-69 的稳定性考察用群体传代的方法考察了高产菌株 XC-lp-69 的斜面
14、传代稳定性，结果见表 5。表 5 XC-lp-69 高产菌株的稳定性考察表 5 结果显示，经过连续传 5 代，菌株 XC-lp-69 的生产能力基本一致，说明菌株 XC-lp-69 的高产性能遗传特性稳定。3 讨论通过 UV 和微波复合筛选得到遗传性能稳定的 lipstatin 高产菌株 XC-lp-69。【参考文献】1 Wendy M, Paul B. Olistatat J. Drugs,1998,56(2):2412 Melia A T, Zhi J, Ze lasko R, et al. The interaction of the lipose inhibitor orlistat
15、with ethanol in healthy volunteers J. Eur J Clin Pharmacol,1998,54(910):77373 Hollander P A, Elbein S C, Hirsch I B, et al. Role of orlistat in the treatment of obese patients with type 2 diabetes J. Diab Care,1998,21(8):12884 周德庆著. 微生物教程M. 北京：高等教育出版社，19985 Markus G, Wolfgang E, Adelbert B, et al. Biosynthesis origin of hydrogen atoms in the lipase inhibitor lipstatin J. J Biol Chem,2000,275(28):211926 Markus G, Wolfgang E, Adelbert B, et al. Biosynthesis of lipstatin J. J Org Chem,2001,66(13):4668
