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1、1反相高效液相色谱法测定绞股蓝 50%总 皂苷提取物中芦丁和槲皮素的含量作者：卢金清， 喻樊， 田耀平， 肖波， 陈黎， 徐玉婷， 詹晓莲 【关键词】 绞股蓝 50%总皂苷提取物；,芦丁；,槲皮素；,反相高效液相色谱法,摘要：目的建立绞股蓝 50%总皂苷提取物中芦丁与槲皮素的含量测定方法。方法采用高效液相色谱仪，使用 TURNER KromasilTMC18 色谱柱（250 mm4.6 mm，5 m），流动相为 0.4%磷酸水溶液甲醇乙腈进行梯度洗脱，流速为 0.5 mlmin-1，检测波长为 360 nm；柱温为 40。结果芦丁在 0.373.70 g 范围内有良好的线性关系，r=0.999
2、 9。槲皮素在 0.050.50 g 范围内有良好的线性关系，r= 0.999 9；芦丁的平均加样回收率为 99.2%，RSD 为 1.69%；槲皮素的平均加样回收率为 99.1%，RSD 为 2.21%。结论该方法简便快捷，准确度高。 关键词：绞股蓝 50%总皂苷提取物； 芦丁； 槲皮素； 反相高效液相色谱法 Determination of Rutin and Quercetin in 50% Total Gypenoside Extraction of Gynostemma by RPHPLCAbstract：ObjectiveTo determine the main flavonoi
3、ds rutin and quercetin in 50% total saponins of Gynostemma by RPHPLC. MethodsThe separation was performed on TURNER KromasilTMC18 column（250 mm4.6 mm，5 m），the mobile phase consisted of 0.4% phosphoric acid- methanol-acetonitrile，with the following rate of 0.5 mlmin-1at 40，the wavelength for measurem
4、ent was 360 nm.ResultsThe calibration curves were linear in the range of 0.373.70 g for rutin (r=0.999 9)and in the range of 0.050.50 g for quercetin (r=0.999 9).The average recovery of compound rutin was 99.2%(RSD=1.69%),and that of compound quercetin was 99.1% (RSD=2.21%).ConclusionThis method is
5、accurate and reproducible. Key words：50% Total saponins of Gynostemma; Rutin; Quercetin; RPHPLC2绞股蓝(Gynostemma)又名七叶胆，是葫芦科绞股蓝属植物。该属植物我国有14 种和 3 变种1。现代药理学证明，绞股蓝具有抑制肿瘤、防止衰老、降低血脂、增强免疫力、镇静止痛、保护心脏和肝脏等作用2。绞股蓝 50%总皂苷提取物是总皂苷含量达 50%的、一种适用于口服制剂生产的原料药，它具有很广的应用范围，故本文采用反相高效液相色谱法，可对绞股蓝 50%总皂苷提取物中的芦丁、槲皮素等成分进行有效的分离和
6、准确的含量测定，并且操作简便、快速、灵敏度高、重现性好，能为建立绞股蓝 50%总皂苷提取物的质量标准提供依据。1 仪器与试药DIONEXP680 高效液相色谱仪（四元泵、Chromeleon 色谱工作站、UVD170U检测器），AT201 电子分析天平（d=0.01 mg，瑞士），芦丁对照品（中国药品生物制品检定所，批号 00809705）、槲皮素对照品（中国药品生物制品检定所，批号0819003）；甲醇（色谱纯，天津大茂化学仪器供应站）、乙腈（色谱纯，天津大茂化学仪器供应站），其它试剂均为分析纯，水为双蒸水。绞股蓝原 50%总皂苷提取物由湖北中医学院中药制剂教研室提供。2 方法与结果2.1
7、色谱条件色谱柱为 TURNER KromasilTM（4.6 mm250 mm，5 m）；以 0.4%磷酸水溶液为流动相 A，以甲醇为流动相 B，以乙腈为流动相 C；按表 1 进行梯度洗脱，检测波长为 360 nm；流速为 0.5 mlmin-1，柱温为 40。理论板数按芦丁、槲皮素峰计算应不低于 3 000。色谱图见图 14。表 1 梯度洗脱（略）3图 1 芦丁对照品 HPLC 图谱（略）图 2 槲皮素对照品 HPLC 图谱（略）图 3 绞股蓝 50%总皂苷提取物供试品的 HPLC 图谱（略）图 4 空白溶剂图谱（略）2.2 供试品溶液的制备 取本品 0.2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精
8、密加入甲醇 50 ml，称定重量，超声处理 30 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，精密量取 20 ml，蒸干，残渣用甲醇溶解并转移至 5 ml 量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。2.3 对照品溶液的制备精密称取芦丁对照品适量，加甲醇制成每毫升含 0.368 mg 的溶液，即得芦丁对照品溶液；精密称取槲皮素对照品适量，加甲醇制成每毫升含 0.054 8 mg 的溶液，即得槲皮素对照品溶液。2.4 标准曲线的制备分别精密吸取芦丁、槲皮素对照品溶液1.0，2.0，4.0，6.0，8.0，10.0 l，注入液相色谱仪，测定峰面积值，结果见表 1，以进样量为横坐标（X），
9、峰面积为纵坐标（Y），绘制标准曲线，得芦丁的回归方程为：y = 61.194 5x + 1.100 4，r=0.999 9；槲皮素的回归方程为：y = 129.036 0X0.833 4，r=0.999 9。线性范围：芦丁为 0.373.70 g；槲皮素为 0.050.50 g。 图 5 芦丁标准曲线（略）图 6 槲皮素标准曲线（略）42.5 精密度实验 取 2.3 项下芦丁和槲皮素对照品溶液各 5 l，分别连续进样5 次，测定峰面积，结果见表 23。芦丁和槲皮素的 RSD 分别为：0.08%和0.26%。表 2 芦丁精密度实验结果（略）表 3 槲皮素精密度实验结果（略）2.6 稳定性实验 取
10、 2.2 项下样品溶液室温放置 0，3，6，9，12，24 h 后测定，结果见表 45，测得芦丁和槲皮素峰面积基本不变，RSD 分别为 1.77%，2.80%，表明样品溶液在 24h 之内稳定。表 4 芦丁稳定性实验结果（略）表 5 槲皮素稳定性实验结果（略）2.7 重复性实验 取同一批样品 5 份，照 2.2 项下的方法依法制备，测定样品中芦丁和槲皮素的含量，结果见表 67。测得芦丁和槲皮素含量的分别为 0.955%和0.222%，RSD 分别为 1.29%和 1.71%。2.8 加样回收实验 取已知含量的本品粉末 6 份，每份 0.1 g，精密称定，分别加入一定量的芦丁、槲皮素对照品，按
11、2.2 项下的方法依法制备，按上述色谱条件进行测定，结果见表 89。芦丁加样回收率为 99.6%，RSD 为 1.07%，槲皮素加样回收率为 99.1%，RSD 为 2.21%。2.9 样品测定 按 2.2 项下方法配制样品溶液 5 份，依法测定，结果见表 10。5表 6 芦丁重复性实验结果（略）表 7 槲皮素重复性实验结果（略）表 8 芦丁加样回收实验结果（略）表 9 槲皮素加样回收试验结果（略）表 10 5 批绞股蓝药材中芦丁、槲皮素含量测定结果（略）3 讨论3.1 提取方法的选择 在绞股蓝原药材芦丁、槲皮素的含量测定中，我们曾对不同极性的提取溶剂（如：不同浓度的甲醇、不同浓度的乙醇）和不
12、同的提取方式（如：超声、回流等）进行过考察，并对提取时间进行了单因素实验，综合考虑以石油醚回流提取，除去脂溶性较大的成分，再以甲醇回流提取 3 h 实际工资效果最好。3.2 检测波长的选择 在检测波长选择中根据对芦丁对照品、槲皮素对照品溶液紫外光谱的测定，在 360 nm 处有最大吸收，最终选择测定波长为 360 nm。3.3 流动相的选择流动相的选择曾使用过乙腈-水、乙腈-甲醇-水、甲醇-水、乙腈-0.4%磷酸等流动相进行等度及梯度洗脱，由于干扰峰难以分离，最后根据分离情况选择了表 1 中的流动相。绞股蓝 50%总皂苷提取物色谱图中除芦丁、槲皮素的色谱峰外还有其他的色谱峰，分离度也较好，亦可以作为指纹图谱用于绞股蓝50%总皂苷提取物的鉴别。经方法学验证，此方法能对绞股蓝 50%总皂苷提取物中的芦丁、槲皮素进行有效的分离和准确的含量测定，并且操作简便、快速、灵敏6度高、重现性好，为建立适用于口服制剂的绞股蓝 50%总皂苷提取物的质量标准提供了科学的依据。参考文献：1 丁树利,朱兆仪,李 勇.绞股蓝及同属植物的生药学研究J.中国药学杂志,1994,29(2)：79.2 杨 静.绞股蓝化学成分研究J.陕西中医，2000,21 (8)：377.
