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1、1柴胡皂苷 d 对酒精性肝纤维化大鼠星形 细胞活化的影响作者：李素婷，杨鹤梅，齐洁敏，梅立新【摘要】 目的研究柴胡皂苷 d（SS d）对酒精性肝纤维化大鼠星形细胞（HSC）活化的影响，以探讨 SS d 抗肝纤维化的作用机制。方法 SD 大鼠随机分为 3 组：酒精组、SS-d 保护组、正常对照组。利用白酒灌胃辅以高脂饲料方法建立大鼠肝纤维化模型，同时给予 SS d 保护，12 周末处死大鼠。免疫组化检测肝组织 平滑肌肌动蛋白（ SMA）的表达，H.E 染色和 Van Gieson 染色观察肝组织病理改变和纤维组织增生，常规生化方法检测肝功能。结果和模型组比较，SS d 明显减少肝组织中 SMA
2、的表达；降低血清 ALT，AST 活性和肝组织羟脯氨酸（Hyp）含量；肝组织病理改变明显好转，纤维组织增生明显减少。结论 SS d 通过降低 SAM 表达，抑制肝 HSC 的活化达到抗肝纤维化作用。 【关键词】 柴胡皂苷 d 肝纤维化 肝星形细胞 平滑肌肌动蛋白Abstract：ObjectiveTo study the effects of saikosaponin-d (SS d) on the activation of Hepatic Stellate Cells(HSC) and to investigate the main mechanism of SS-d in protect
3、ion of liver fibrosis.MethodsSD rats were randomly divided into 3 groups：normal group,ethanol-fed group, SS d interventional group.56% distilled alcohol and high fat diet were given orally to the rats of the ethanol-fed group and the SS-d group every day,the rats of SS d group were injected intraper
4、itoneally SS d 2.0 mgkg-1 once daily.Rats were sacrificed 12 weeks later. The expression of smooth muscle actin ( SMA) was detected by immunohistochemistry method. Pathological change in liver tissue was observed under light microscope by H.E and Van-Gieson staining; the content of liver tissue hydr
5、oxyproline(Hyp) and liver histopathology were also examined by kivchemistry.ResultsCompared with model group，SS d could reduce the expression of SMA markedly , improve the pathological changes of liver tissue and decrease the production of fibers significantly，decrease the levels of serum alanine tr
6、ansaminase (ALT),aspartate transaminase(AST) and the contents of liver Hyp 2significantly .ConclusionSS d can inhibit hepatic fibrosis through inhibiting the expression of SMA in HSC.Key words：SS d； Liver Fibrosis； Hepatic stellate cell； SMA长期过量饮酒可引起酒精性肝病，包括肝脂肪变及炎症损伤，严重者可发展为肝纤维化，甚至导致难以逆转的肝硬化。酒精性肝纤维化
7、是酒精性肝病发展到肝硬化的重要阶段，是一可逆过程，如能去除不利因素，消除肝纤维化将成功阻断肝硬化的发生1，2。研究表明，肝星形细胞（hepatic stellate cell，HSC）是肝纤维化时肝脏细胞中胶原的主要来源细胞，HSC 活化是肝纤维化形成的中心环节3，4，本实验用白酒灌胃制备大鼠酒精性肝纤维化模型，观察柴胡皂苷 d（SS d）对HSC 活化的影响，以探讨中药单体 SS d 对酒精性肝纤维化预防作用及其机制。1 材料与仪器1.1 动物Sprague Dawley 大鼠，雄性，清洁级，体重（20021）g，北京实验动物管理中心提供。1.2 试剂SS d（纯度为 98）：昆明长春花科技
8、有限公司提供，临用前以蒸馏水配置；56度红星二锅头白酒,北京红星酿酒厂生产；ALT，AST，羟脯氨酸(Hyp)检测试剂盒,北京中生生物工程公司； SMA 单抗：购于武汉博士德工程有限公司。1.3 仪器半自动生化分析仪（MD 100），美国 Bayer 公司生产；721W 微机型分光光度3计，上海光学仪器五厂产品；Olympus 光学显微镜和摄像显微镜，德国 Leica 公司产品。2 方法2.1 动物分组及模型的建立参考文献5略有改动， 取 SD 大鼠 40 只，随机分为 3 组。酒精组（16 只），56 度红星二锅头白酒用蒸馏水配制成含 40%酒精的白酒，按 10 mlkg-1 每日分两次灌胃
9、造模 4 周，第 5 周酒精浓度升至 50，继续每日分 2 次灌胃 8 周，并辅以高脂饲料（由颗粒料、胆固醇和猪油按 79120 的比例微波炉加热制成）；SS d组（14 只），除每天灌胃白酒和高脂饲料外（方法同酒精组），每天上午 11 点腹腔注射 SS d 2 mgkg-1；正常对照组（10 只），普通饲料通常方法喂养，并以等量的生理盐水作相应处理。各组于造模起第 12 周末处死大鼠,采集血清及肝组织标本待测相关指标。2.2 指标检测应用半自动生化分析仪按赖氏法测定血清 ALT，AST 活性；消化法测定 Hyp含量。2.3 肝组织形态学观察H.E 染色光镜下观察肝组织病理改变。V-G 胶原纤
10、维特殊染色，进行肝纤维化病理学分级。2.4 肝组织 SMA 免疫组化法染色4采用 SABC 法检测 SMA 在大鼠肝组织中的表达。全自动图象分析系统上采用 HIPAS2000 型图象分析软件进行定量分析，每张切片随机选取 10 个视野显微摄影系统放大 400 倍，测定阳性物质所占面积及平均光度，两者乘积越大表明组织中该抗原含量越高。 2.5 统计学处理数据以s 表示，用 SPSS 计算机软件进行统计学分析，组间比较采用 t 检验。3 结果3.1 肝功能及 Hyp 含量的测定如表 1 所示，酒精组血清 ALT，AST 活性明显升高，肝组织 Hyp 含量亦明显升高；给予 SS d 保护后，血清 A
11、LT，AST 活性和肝组织 Hyp 含量明显降低(P0.01)；表明 SS d 有保护肝细胞，拮抗肝纤维化形成的作用。表 1 SS d 对血清 ALT，AST 活性和肝脏 Hyp 含量的影响(略)3.2 肝纤维化病理学观察 H.E 染色：正常组肝组织结构正常，肝细胞排列整齐，肝小叶结构完整，无肝细胞脂肪变性坏死；酒精组大鼠肝组织病理损伤严重，肝小叶结构紊乱，肝细胞呈气球样变及脂肪变性，肝细胞肿胀，胞质疏松，可见较大脂滴；汇管区有炎症细胞浸润，胶原纤维沿汇管区及中央静脉周围向肝小叶内延伸，肝小叶失去正常的结构特点；SS-d 保护组上述症状明显减轻，肝细胞有轻度空泡样变性，纤维组织增生明显减少。V
12、-G 染色：正常组无明显胶原纤维，酒精组有大量胶原纤维伸入肝小叶，有部分假小叶形成,SS-d 组胶原纤维明显减少，纤维隔较薄，无假小叶形成。肝纤维化积分：与酒精组相比，SS-d 保护组病理学分期有明显改善（P0.01）。见表 2。表 2 SS-d 对大鼠肝纤维化积分及 -SMA 表达量化结果的影响(略)53.3 肝组织 -SMA 的表达及量化结果肝组织切片免疫组化染色显示：正常组肝组织 -SMA 主要表达于汇管区动、静脉壁，而酒精组 -SMA 在汇管区、纤维间隔和肝血窦处均呈阳性表达；SS-d 保护组 -SMA 表达较模型组有明显减弱，仅在汇管区和纤维间隔内有少量阳性细胞。图象结果分析有显著差
13、异（P0.01）。见表 2。4 讨论酒精性肝纤维化的病理特征是以胶原蛋白为主的细胞外基质在肝脏的过度增生和广泛沉积。活化的 HSC 是细胞外基质成分主要的细胞来源，是各种因素所致肝纤维化发生的重要环节5。HSC 是位于肝窦间隙内的一种特殊状态的成纤维细胞，正常情况下，细胞内存在脂滴，其代谢和功能不活跃，合成胶原功能表达受抑制。在酒精性肝纤维化发展过程中，乙醇及其代谢产物乙醛损伤肝细胞产生大量氧自由基，自由基通过旁分泌和自分泌激活 HSC，也可通过细胞因子等多种因素刺激 HSC 活化。HSC 的激活常伴有 NF-B 等转录因子的激活及 c-myb 基因表达的增强，而 c-myb 蛋白可结合 -S
14、MA 基因调控区，提高 -SMA 的表达68。所以 -SMA 作为 HSC 活化的主要标志,与 HSC 活化的程度及数量呈正相关9。活化的 HSC 不但数量增加，并且向成纤维细胞转化 ，合成大量以胶原蛋白、层粘蛋白为主的细胞外基质，广泛沉积在汇管区和肝小叶内，最终导致肝纤维化。因此，合理抑制 HSC 活化可逆转肝纤维化的发展，达到在抗肝纤维化目的。本研究结果显示，酒精性肝损伤后，肝细胞坏死、炎症细胞浸润，血清ALT，AST 活性和肝组织 Hyp 含量明显升高；免疫组化显示 -SMA 在汇管区、纤维间隔和肝血窦处均呈阳性表达； V-G 染色显示肝内纤维组织大量增生。表明肝6细胞坏死及纤维组织增生
15、与 HSC 活化有关。而给予 SSd 保护后，肝功能及病理改变明显好转，肝组织内 -SMA 表达明显减少，仅在汇管区和纤维间隔内有少量阳性细胞，纤维组织增生明显减轻，肝小叶基本正常。表明 SS-d 对酒精性纤维化具有明显的拮抗作用，而降低 -SMA 表达，抑制 HSC 活化和增殖，减少肝内纤维组织增生可能是其主要机制之一。【参考文献】1赵箐.酒精性肝纤维化中肝星状细胞活化的机制研究进展J.国外医学药学分册, 2006，33（3）：198.2Cui wei,Su Xiao-lin,Fu Bao-yu.Kangxianfufang-1 prevents fibrosis in alcoholic
16、liver disease in the ratJ.World Chin J Digestol,2002,10:1245.3Friedman SL.Molecular regulation of hepatic fibrosis,an integrated cellular response to tissue injuryJ.J Biol Chen,2000,275(4):2247.4郭顺根， 张 玮，江 涛，等.活血化瘀方药理血清对离体肝星形细胞影响的研究J.北京中医药大学学报，2003，26（1）：24.5李舒丹，厉有名，虞朝辉.大鼠慢性酒精性肝损伤模型的建立J.浙江医学，2002，24（9）：524.6Kusunose M,Qiu B,Cui T,et al.Effect of Sho-saiko-to extract on hepatic inflammation an
