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1、1二至丸与失笑散对胆汁淤积性肝纤维化 大鼠 uPA 的调控作者：陈珺明 安德明 柳涛 郑培永 邢练军 季光【摘要】 目的研究不同治则中药复方二至丸与失笑散对胆汁淤积性肝纤维化大鼠uPA/PAI-1 纤溶途经的调控作用。方法 SD 雄性大鼠 60 只随机分为假手术组和造模组, 造模组于 1 周后随机分为模型对照组、二至丸组、失笑散组及合方组。各治疗组分别给予相应药物灌胃,模型对照组和假手术组给予等量生理盐水灌胃,4 周末处死大鼠。观察内容包括一般情况、肝功能、肝组织病理、Western 印迹法检测uPA 蛋白表达、RT-PCR 法检测肝组织 PAI-1 的表达。结果与模型对照组比较,3个中药复方
2、均能降低胆汁淤积性肝纤维化大鼠血清 ALP，ALT，AST 水平（P0.01）,失笑散及合方能降低 TBil（P0.01）;合方改善 ALP，ALT 优于两个单方。3 个复方均能不同程度地减轻模型大鼠肝纤维化程度（P0.01）,合方优于两个单方。3 个复方均能显著降低胆汁淤积性肝纤维化大鼠 PAI-1 mRNA 表达（P0.01），提高 uPA 的表达（P0.05，P0.01）。合方对上述环节的调控优于两个单方。结论不同治则中药复方均能改善胆汁淤积性肝纤维化大鼠肝功能，减轻纤维化程度,合方作用优于两个单方，其机制可能与通过调控 uPA/PAI 纤溶途径有关。 【关键词】 胆汁淤积性肝纤维化；二
3、至丸；失笑散； 尿激酶型纤溶酶原激活物；尿激酶型纤溶酶原激活物抑制物Abstract：ObjectiveTo study the regulatory effects of the Chinese medicine complex prescriptions Erzhiwan and Shixiaosan on urokinase type plasminogen activator（uPA）/ plasminogen activator inhibitor-1 ( PAI-1) fibrinolytic system 2cholestasis-induced liver fibrosis r
4、ats .MethodsSixty male Sprague-Dawley (SD)rats were randomly divided into 2 groups: Sham operation group and model group. Bile duct ligation method was used to make the model of cholestasis-induced liver fibrosis. One week later, after operation, the model group rats were randomly divided into four
5、groups :Untreated group , Erzhiwan group , Shixiaosan group and Erzhiwan compound with Shixiaosan(ECS) group .Each medicine intervention group was given corresponding medicine by intragastric administration. Sham operation group and untreated group were given sodium chloride with equal dosage. At th
6、e end of 4th week , all of the rats were sacrificed and sampled. General state of health , hepatic function (alanine aminotransferase(ALT), aspartate aminotransferase(AST),alkaline phosphatase(ALP), total bilirubin(TBil), and pathological histology of hepatic tissue were recorded and measured. uPA w
7、as detected with reverse transcription-polymerase chain raction (RT-PCR) and PAI-1with western blot.ResultsThe serum ALP , ALT and AST levels in three Chinese medicine complex prescription group rats and the serum level of TBil in Shixiaosan and ECS group rats were decreased compared with model grou
8、p (P0.01).ECS was better than simple recipe in ALP and ALT. All of three complex prescriptions could inhibit liver fibrosis to some extent (P0.01) , but ECS was more obviously than simple recipe.PAI-1mRNA expression was significantly decreased and uPA expression was significantly increased in the ab
9、ove three Chinese medicine complex prescription groups as compared to model group(P0.01),ECS group was the lowest or highest .ConclusionChinese mdeicine complex prescriptions ( Erzhiwan , Shixiaosan and ECS) can improve the Hepatic function of cholestasis- induced liver fibrosis rats, alleviate hepa
10、tic fibrosis,and ECS is better than simple recipe. The mechanism may be related to regulating the uPA/ PAI-1 fibrinolytic system.Key words：cholestasis-induced liver fibrosis ; Erzhiwan; Shixiaosan; uPA; PAI-1肝纤维化的本质是细胞外基质(extracellular matrix ,ECM)合成增多而降解相对减少，使过多的 ECM 沉积于肝内。肝星状细胞(hepar stellate cell
11、, HSC)是调控肝脏ECM 沉积的最重要细胞，其激活是肝纤维化发生的中心环节。HSC 对 ECM 调节的重要途径之一就是通过尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)和其抑制物(PAI)的差异表达，调控纤溶酶和基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP)家族的活性，以维持 ECM 合成与降解之间的平衡。祖国医学普遍认为, “正虚血淤”是肝纤维化的基本病机1。本研究旨在观察补益肝肾和活血化淤的经典名方二至丸和失笑散及其合方对大鼠胆汁淤积性肝纤维化形成的影响及其对 uPA/PAI 的调控3作用,为中医药防治以细胞外基质沉积为特征的肝纤维化提供更广阔的途径。1 材料与仪器1.
12、1 动物SD 雄性大鼠 60 只, SPF 级,体重(26020) g,购自上海斯莱克实验动物有限责任公司,许可证号: SCXK (沪) 2003 - 0003。饲养于上海中医药大学附属龙华医院实验动物中心, 自由饮食。12 试剂与器材盐酸氯胺酮(上海第一生化药业公司,国药准字：H31021897 ); HE、天狼猩红染液(上海虹桥乐翔医用试剂有限公司) ;血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）、血清门冬氨酸氨基转移酶（AST）、血清总胆红素（TBil）、血清碱性磷酸酶（ALP）试剂盒(南京建成生物工程研究所) ; DEPC ( Sigma ) ; Trizol Rea-gent、 AMV RT/ P
13、CRKit、DNAMarker 、引物合成(上海申能博彩生物科技有限公司);UV-2102C 分光光度计(尤尼克公司) ; PCR 仪、DNA 水平(Biorad) ;RNA/DNA calculator( Pharmacia ) ;凝胶成像系统(上海四星生物技术有限公司); uPA 抗体试剂盒(Santa Cruz Biotechnology INC)。1.3 药物制备 二至丸出自清汪昂医方集解，由旱莲草、女贞子等份（各 9 g）组成; 失笑散出自宋太平惠民和剂局方, 由五灵脂、蒲黄等份（各 6 g）组成; 合方: 由旱莲草、女贞子各 9 g , 五灵脂、蒲黄各 6 g 组成。根据大鼠剂量=
14、人剂量35 (人转换因子) / 6 (大鼠转换因子)计算出人鼠等效剂量二至丸为 175 gkg- 1 d -1 , 失笑散为41.17 g kg - 1 d- 1 , 合方为 2.92 g kg - 1 d - 1 ,均按传统工艺制备成水煎剂, 减压浓缩分别至 1.75，1.17，2.92 g/ ml 备用(所有药物制备、质控由上海中医药大学附属龙华医院制剂中心完成)。2 方法2.1 模型制备参照文献2采用胆管结扎复制胆汁淤积性肝纤维化模型。术前禁食不禁水 12 h，盐酸氯胺酮 100 mg/ kg 肌肉注射麻醉，常规腹部皮肤消毒，沿腹正中线切开皮肤，暴露胆总管，于远近端结扎胆总管，中间离断，
15、关腹；假手术组仅开腹暴露并游离胆总管不结扎, 关腹。2.2 动物分组及给药将大鼠随机分为假手术组 10 只,其余 50 只为造模组, 术后因结扎线脱落、消化道出血及腹水等原因有 8 只死亡，造模 1 周后, 造模组随机分为模型对照组(12 只) , 二至丸组、失笑散组及合方组（各 10 只）。术后 1 周开始,各治疗组分别给予相应药物灌胃, 1 次/ d , 共计 3 周;假手术组与模型对照组以同体积生理盐水灌胃。4 周末以盐酸氯胺酮腹腔注射麻醉(100 mg 2 ml- 1 kg- 1 ), 腹主动脉采血, 处死全部实验动物, 分离血清, - 80 保存备用。摘取肝脏称重后, 于肝右叶切取1
16、.0 cm1.0 cm1.0 cm 大小肝组织 2 块, 4 %中性甲醛溶液固定,剩余肝脏- 80条件下保存备用。2.3 指标检测52.3.1 一般情况 包括精神状态、活动情况、皮毛光泽度、食量、大小便情况等。2.3.2 肝脏形态包括肝脏的外形、色泽、质地。2.3.3 生化指标测定 ALT，AST，TBil ，ALP 按试剂盒说明书操作。2.3.4 病理学检测HE 染色、胶原纤维染色(天狼猩红染色) 、肝纤维化程度分级标准3：汇管区纤维组织无增生为“-”; 增生后面积占肝小叶 1/ 3 以下为“+”; 占肝小叶 1/ 32/ 3 为“+ +”; 占肝小叶 2/ 3 以上为“+ + +”。每个“+”记 1 分, 每个标本记总分。积分越高, 表明肝脏纤维化程度及病理损害越严重。2.3.5 Western 印迹法检测肝组织中 uPA 蛋白含量 取- 80保存的肝组织标本各 100 mg, 剪碎后于液氮中研磨成粉末状, 收集于 Eppendorf 管后,提取肝组织蛋白匀浆, 以紫外分光
