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1、15 种中草药提取物对致病性弧菌的抑菌 作用研究作者：管淑玉，林家勤，曾宇，刘广锋【摘要】 目的 研究 5 种中草药对致病弧菌的抑菌活性，为水产品的安全用药提供参考。方法 采用纸片法和试管法，以溶珊瑚弧菌(Vibrio coralliilyticus)、塔氏弧菌(Vibrio tubiashii)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、鲨鱼弧菌 (Vibrio carchariae)为供试菌株，测定中草药不同极性萃取部分的抑菌圈和最小抑菌浓度。 结果 夹竹桃叶、芒果叶、苦楝叶和羊蹄甲叶 4 种中草药乙酸乙酯萃取部分对供试弧菌有很好的抑菌作用；苦楝叶和羊蹄甲叶石油醚萃取部
2、分对副溶血弧菌有抑菌作用；芒果叶的水溶性部分对塔氏弧菌有很强的抑菌作用；枇杷叶提取物对 4 株弧菌均无抑制作用。结论 除枇杷叶外，其他 4 种中草药可不同程度的抑制致病弧菌的生长，其抑制致病弧菌的活性成分有待于进一步研究。 【关键词】 中草药；弧菌；抑菌活性；最小抑菌浓度Abstract:Objective To study the anti bacteria activities of five herbs, to provide references for the safe drugs of aquaculture. Methods Using Vibrio coralliilyticu
3、s, Vibrio tubiashii, Vibrio parahaemolyticus and Vibrio carchariae as the tested bacteria, the inhibition zone and the minimal inhibitory concentration（MIC）were measured. Results The extracts, extracted with ethyl acetate from the leaves of Nerium indicum Mill., Mangifera indica Linn., Melia azedara
4、ch L. and Bauhinia purpurea could inhibit vibrio. And the extracts, extrated with petroleum ether from leaves of Melia azedarach L. and Bauhinia purpurea can inhibit Vibrio parahaemolyticus, too. The remainder extracts of Mangifera indica Linn.showed strong inhibition effect on Vibrio tubiashii. Whi
5、le the extracts of Eriobotrya japonica showed no inhibition effect. Conclusion Four of the five herbs show anti bacteria activities and the study on active compounds should be done in future.Key words:herb；Vibrio；anti bacteria activity；minimal inhibitory concentration2随着现代集约化和规模化水产养殖的发展，养殖中水产动物感染细菌的
6、几率大大增加。为了预防水产动物疾病，大量抗生素类药物被用作水产药物。滥用抗生素使致病菌的耐药性增加，药物的有效性降低，同时也加剧了环境污染，残留药物降低了水产成品的品质，引发了市场对水产品安全性的质疑，降低了水产商品在国际贸易中的竞争力。因此，开发替代抗生素的高性能、无毒副作用、安全高效的抑菌药物引起了广大科研人员的关注。本研究以夹竹桃（Nerium indicum Mill）、芒果（Mangifera indica Linn.）、苦楝（Melia azedarach L.）、羊蹄甲（Bauhinia purpurea）和枇杷（Eriobotrya japonica）等 5种中草药为研究对象，
7、选取对水产品危害较大的 4 株致病弧菌为实验菌株，旨在通过抑菌活性的筛选研究，获得安全有效的天然抑菌药物。1 材料与方法1. 1 仪器及试剂主要仪器有 DFT 200 型摇摆式高速中药粉碎机（温岭市大德中药机械有限公司）、RE52CS 型旋转蒸发器（上海亚星生化仪器厂）、LDZX40CI 型立式自动电热压力蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械厂）、150A 生化培养箱（金坛市迅生仪器厂）、SW CJ 1D 型洁净工作台（苏州苏洁净化设备有限公司）。所用试剂均为分析纯。使用的培养基为 2216E 培养基。环丙沙星纸片为杭州天和微生物试剂有限公司产品。供试菌种：溶珊瑚弧菌(Vibrio coralliil
8、yticus)、塔氏弧菌(Vibrio tubiashii)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、鲨鱼弧菌 (Vibrio carchariae)由南海水产研究所提供。31. 2 供试药材及预处理供试药材为广东常见的 5 种植物的叶，供试的 5 种植物分别是夹竹桃（Nerium indicum Mill）、芒果（Mangifera indica Linn.）、苦楝（Melia azedarach L.）、羊蹄甲（Bauhinia purpurea）、枇杷（Eriobotrya japonica）。5 种供试植物均采自广东药学院药用植物园，原植物均经药用植物教研室严寒静
9、副教授鉴定。供试植物叶片阴干后粉碎成粗粉备用。取供试药材粗粉各 20 g，用 60%（）乙醇回流提取 90 min 后滤过，滤液减压浓缩至 50 mL 后，依次用等体积石油醚、乙酸乙酯萃取。将 3 种萃取液分别减压浓缩至 1 g/mL（以生药计），即得石油醚萃取部分（）、乙酸乙酯萃取部分（）和水溶部分（）。1. 3 病原菌的分离和菌悬液制备1将 4 株供试菌分别划线接种于平皿培养基中，于 28 培养 24 h 后，挑选单个菌落转接于斜面培养基中，28 培养 24 h 后，用 2 mL 0.9% NaCl 溶液进行洗脱即制得所需菌悬液。1.4 纸片法抑菌试验按无菌操作规程2，吸取 4 株供试菌悬
10、液各 0.1 mL，分别加到平板培养基上并涂布均匀。将预先灭菌烘干并浸蘸定量药液的滤纸片（直径为 5 mm）平贴在含菌培养基上。同时用浸有相应溶剂的滤纸片做对照。每份样品做 3 份，结果取平均值。28 倒置培养，并于 12 h 和 24 h 观察抑菌效果，测定抑菌圈的直径。以环丙沙星为阳性对照。1.5 试管稀释法测最低抑菌浓度4采用试管稀释法，以相应溶剂作对照，测定有抑菌活性的药液的最低抑菌浓度(MIC)。每种提取物为一组，每组取无菌试管 12 支，于第 1 管中加入 1.0 mL 浓度为 2105 CFU(colony forming units)/mL 的菌液，在 210 管中每管加入 1
11、.0 mL 浓度为 1105 CFU/mL 菌液，在第 1 管内加入中药浓缩液 1.0 mL，充分混匀后取1.0 mL 放入第 2 管，混匀后再取 1.0 mL 放入第 3 管，第 1 管内的药物浓度为原液的 1/2，第 2 管为第 1 管的 1/2，其余类推，直至第 10 管，每种药物的第 11 管作菌液对照（仅加菌液不加中药），第 12 管作药物对照（仅加中药不加菌液），以能抑制细菌生长（培养后培养基仍清亮）的最小药物浓度为其 MIC。 2 结果与分析2.1 纸片法抑菌试验结果见表 1。由表 1 数据可知，阳性对照环丙沙星对 4 株菌均有抑制作用，而中草药提取物只对溶珊瑚弧菌、副溶血弧菌和
12、塔氏弧菌 3 株菌产生抑制作用。其中，夹竹桃叶、苦楝叶和羊蹄甲叶对副溶血弧菌和溶珊瑚弧菌有抑制作用；芒果叶对溶珊瑚弧菌和塔氏弧菌有抑制作用；枇杷叶对 4 株供试致病菌均无抑制作用。比较不同提取部位抑菌作用可知，乙酸乙酯提取部分的抑菌活性较明显，苦楝叶、芒果叶、夹竹桃叶和羊蹄甲叶乙酸乙酯萃取部分均产生抑菌圈；石油醚萃取部分的抑菌结果显示,苦楝叶、羊蹄甲叶石油醚提取部分能产生抑菌圈；水溶性部分只有芒果叶产生抑菌圈。分析不同供试菌敏感性发现，副溶血弧菌和溶珊瑚弧菌两株供试菌对夹竹桃叶、苦楝叶和羊蹄甲叶提取物均敏感，能产生不同大小的抑菌圈；塔氏弧菌只对芒果叶的水溶性部分敏感；鲨鱼弧菌对中草药提取物则完
13、全不敏感。表 1 5 种植物不同萃取部分的抑菌圈（略）注：石油醚萃取部分简称为 I,乙酸乙酯萃取部分简称 II,水溶部分简称 III。52.2 试管稀释法测定最低抑菌浓度结果见表 2。由 MIC 数据可知，芒果叶提取物对溶珊瑚弧菌和塔氏弧菌的 MIC 最低，表明芒果叶提取物在质量浓度为 12.5 mg/mL（以生药计）时即可完全抑制两菌的生长。苦楝叶和羊蹄甲提取物对溶珊瑚弧菌和副溶血弧菌的 MIC 均为 50.0 mg/mL（以生药计），夹竹桃对溶珊瑚弧菌和副溶血弧菌的 MIC 为 25.0 mg/mL（以生药计）。其他组分的 MIC 均大于 200 mg/mL。表 2 5 种植物不同萃取部分
14、的最小抑菌浓度（略）注：“+”表示 MIC200 mg/mL3 讨 论弧菌（Vibrio）因菌体有一个弧状弯曲而得名，广泛分布于自然界中，水环境中较多，对人、鱼、蛙及其他动物均有致病性，其中霍乱弧菌和副溶血弧菌是引起人类细菌性食物中毒的首要食源性致病菌。目前，从海水、淡水和养殖水体中分离鉴定出弧菌（Vibrio）共有 100 多种，其中多数是致病菌，严重危害人类的食品安全。本研究所用供试菌鲨鱼弧菌和副溶血弧菌也是美国临床微生物手册记载的人类致病菌。通过研究发现，鲨鱼弧菌对 5 种中草药均不敏感，而其他 3 种致病弧菌均有敏感中草药，说明该菌具有对抗普通抑菌药物的生长机制，应对其机理展开进一步的
15、研究。本研究所选 5 种中草药是我国岭南地区资源丰富、广泛易得的药材。本研究结果表明，除枇杷叶外，其他 4 种均有抑制致病弧菌的作用。比较文献结果发现，夹竹桃粗提物对大肠杆菌、粪肠球菌等的 MIC 为 0.5 g/mL3，本研究结果表明夹竹桃乙酸乙酯萃取物对溶珊瑚弧菌和副溶血弧菌的 MIC 仅为 25mg/mL。MIC 结果差异的产生可能与以下 2 个因素有关：菌种不同，敏感性不同。本研究采用6的是水产养殖中的致病弧菌，而文献所用供试菌为杆菌和球菌；药材的提取方法不同，本研究采用粗提后再萃取的方法处理药材，一定程度上精制了样品，去除了干扰，而文献中药物的处理方法仅为水提处理。本研究中，芒果叶的
16、乙酸乙酯萃取物和水溶性部分分别对溶珊瑚弧菌和塔氏弧菌有较好的抑菌作用，说明萃取法可以有效地将不同活性的成分分开，比较文献所用的水煎煮法4，萃取法的优势在于将不同极性的成分进行了粗分，为进一步研究活性成分提供了依据。实验结果表明，苦楝叶和羊蹄甲叶分别对溶珊瑚弧菌和副溶血弧菌具有较好抑菌作用，苦楝叶的抑菌功效与其清热燥湿的作用相符合，而羊蹄甲根的抗菌活性成分已被分离获得5。此外，本研究采用环丙沙星为阳性对照药，实验发现环丙沙星对 4 株弧菌有广泛且明显的抑菌作用，说明该 4 株菌对环丙沙星较敏感且没有产生耐药性。虽然环丙沙星对 4 株弧菌的抑菌作用优于中草药提取物，但由于其成分和作用机理单一，临床上已有耐药菌出现。因此，不宜在水产养殖过程中长期用药。相比之下，中草药提取物由于成分复杂，作用机理不统一，较难产生耐药菌，有较高的实际应用价值，有必要进一步开发。【参考文献】1刘广锋，周世宁，徐力文，等. 杂色鲍幼苗“急性死亡脱落症”病原菌分析J. 中国水产科学，2006:13(4)：655-661.2俞树荣.
