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1、1妍婷颗粒对 LPS 诱导小鼠脾细胞产生 IL-1 的影响【摘要】 目的研究中药复方妍婷颗粒对脂多糖（LPS）诱导小鼠脾细胞产生白介素-1（IL-1）的影响，初步探讨妍婷颗粒对慢性盆腔炎免疫调节的内在机制。方法对经 LPS 诱导的小鼠脾细胞给予不同浓度妍婷颗粒含药血清进行干预，用 ELISA法检测上清液中 IL-1 含量，用 RT-PCR 法检测细胞中 IL-1 mRNA 的表达。结果正常小鼠脾细胞合成和分泌少量 IL-1，经 LPS 诱导后 IL-1 分泌量明显升高（P0.01），IL-1 mRNA 表达增强。不同浓度妍婷颗粒干预呈剂量依赖方式降低 LPS 诱导的小鼠脾细胞 IL-1 的分泌
2、量与表达（P0.01）。结论妍婷颗粒具有抑制 LPS 刺激小鼠脾细胞产生 IL-1 的作用，据此推测妍婷颗粒抗炎、免疫调节作用机理可能与其抑制脂多糖介导的 IL-1 释放有关。 【关键词】 妍婷颗粒 脂多糖 小鼠脾细胞 白介素-1妍婷颗粒方为导师侯丽辉教授多年临床经验与中医理论相结合，总结出的治疗慢性盆腔炎的经验方，已在临床广泛应用多年，且疗效显著。慢性盆腔炎是妇科常见病、多发病，有缠绵不愈、易于复发的特点，近年其发病率呈上升趋势，因此对慢性盆腔炎的认识与研究日益广泛和深入。IL-1 具有广泛的免疫调节、致热、介导炎症等作用，是慢性盆腔炎发生发展的一种重要细胞因子。本研究观测妍婷颗粒对 LPS
3、 诱导小鼠脾细胞产生 IL-1 的影响，从分子免疫学角度探讨妍婷颗粒治疗慢性盆腔炎的机理和有效性。1 器材21.1 仪器与试剂超净工作台（苏州净化）， 二氧化碳培养箱（SHELLAB）， 台式高速离心机(BECKMAN)， 电热鼓风干燥箱（天津泰斯特）， AB204 型电子天平(Sartorius)，磁力加热搅拌器 78-1（江苏金坛）， 双蒸水馏器(MILLI-Q)，752 型分光光度计（上海菁华科技仪器有限公司）， PCR 仪(Eppendorf), 稳压稳流电泳仪（北京市六一仪器厂）。改良型 RPMI-1640 培养液(Hyclone)，胎牛血清（杭州四季青），D-PBS（北京中山金桥）
4、， LPS (Sigma)，Trizol(Lnvitrogen), 引物(Sangon), 氯仿（天津市天大化学试剂厂），异丙醇（天津市恒兴化学试剂制造有限公司），琼脂糖(Solarbio)，PCR 所需试剂购自 Promega 及 TakaRa 公司，ELISA 试剂盒（北京北方生物技术研究所）。1.2 动物 68 周龄昆明雌性小鼠，体重 2025 g，由黑龙江中医药大学实验动物中心提供。1.3 药物 妍婷颗粒方组成：丹参、赤芍、元胡、三棱、莪术、红藤、败酱草、皂刺、川楝子。药物来源于黑龙江中医药大学附属第一医院制剂室，制成中药颗粒剂，蒸馏水溶解，最后浓缩含生药浓度为 1.75 g/ml。2
5、 方法2.1 含药血清的制备取体重 2025 g 的正常昆明雌性小鼠，按人鼠体重比换算后，以妍婷颗粒方灌胃（20 ml/kg，约相当于成人用量的 7 倍），2 次/d ，连续 3 d，最后 1 次给药后 2 h，颈动脉取血，以 2 000 r/min 离心 5 min，分离血清，并于57灭活（30 min），20冻存备用1。2.2 小鼠脾细胞的分离培养小鼠颈椎脱位处死，置 75%乙醇中浸泡 35 min，3仰卧位，无菌取脾脏，用 D-PBS 液冲洗，置于平皿中，移入超净工作台，再以滤过的 D-PBS 快速、充分洗涤后，置于烧杯上的 200 目不锈钢网，将脾组织用眼科剪剪成小块，用注射器芯研磨脾
6、，至脾呈白色絮状，D-PBS 液冲洗过滤脾细胞，收集细胞悬液无菌离心管中，1 500 r/min 离心 10 min，使细胞沉淀，弃上清，再以 D-PBS 液洗涤细胞 2 次，RPMI-1640 培养液洗涤细胞 1 次(均以 1 500 r/min 离心 10 min)。以 RPMI-1640 培养液（含 10%胎牛血清，含有青霉素、链霉素各 100 u/ ml）悬浮细胞，0.4%台盼蓝染色显示活力，细胞存活数大于 90%，调整细胞密度，按1106/ml 密度接种细胞，置 37，5%CO2 培养箱中培养。培养 12 h 后加 LPS 及不同浓度妍婷颗粒进行干预（LPS 浓度为 10 gml2；
7、妍婷颗粒浓度分别为培养基的 5%，10%，20%1）。2.3 实验分组实验分组为正常组；LPS 处理组（10 gml）；5%妍婷颗粒LPS处理组；10%妍婷颗粒LPS 处理组；20%妍婷颗粒LPS 处理组。2.4 实验检测给予 LPS 及妍婷颗粒干预 24 h3后收集上清及细胞。2.4.1 培养液上清中 IL-1 含量测定收集上清液20冰箱保存，按 ELISA 试剂盒说明进行检测。2.4.2 RT-PCR 法检测细胞中 IL-1 mRNA 的表达用 Trizol 提取细胞总 RNA,测总 RNA 纯度和含量,逆转录成 cDNA, IL-1 的上游引物为:5-AGG CTC CGA GAT GA
8、A CAA-3；下游引物为: 5-AAG GCA TTA GAA ACA GTC C-3, 产物长度为 464bp, PCR 总反应体为 25l。扩增条件为：95预变性 5 min，然后在90 30 s，52.5 30 s，72 30s 条件下循环 3035 次，最后 72延伸 10 min。PCR 产物以 15 g/L 琼脂糖凝胶电泳检测,自动凝胶成像分析仪下观察并保存4图像，IL-1 相对含量以“（细胞因子基因表达密度/GAPDH 表达密度)100%”表示4。2.5 统计学分析实验数据用s 表示,采用 SPSS11.0for windows 统计软件进行统计学处理分析,组间比较采用方差分析
9、。 3 结果3.1 各组细胞上清液 IL-1 浓度变化 LPS 组分泌 IL-1 比正常组多,差异有显著性(P0.01 ) 。含妍婷颗粒组(5%妍婷颗粒10g/ ml LPS，10%妍婷颗粒10g/ ml LPS，20%妍婷颗粒10g/ ml LPS) IL-1 分泌量比 LPS 组低,差异显著性逐渐增强( P0.05,P0.05,P0.01)。见表 1。表 1 妍婷颗粒对 LPS 介导小鼠脾细胞分泌 IL-1 的影响（略）与正常组比较，P0.01；与 LPS 组比较，P0.05，P0.05，P0.013.2 RT-PCR 检测细胞中 IL-1mRNA 的表达正常组 IL-1mRNA 的表达较
10、弱,LPS 组 IL-1mRNA 的表达明显增强,含妍婷颗粒组 IL-1mRNA 的表达逐渐减弱。见图 1。图 1 妍婷颗粒对小鼠脾细胞 IL-1 mRNA 表达的影响（略）4 讨论慢性盆腔炎往往是多种病原体的混合感染，其中包括大肠杆菌、脆弱类杆菌、淋病奈氏菌、沙眼衣原体等多种革兰氏阴性菌（G-），脂多糖（LPS）是革兰氏阴性菌（G-）细菌感染的主要致病因子5。LPS 也称细菌内毒素，是构成革兰氏阴性菌5（G-）细胞外壁的主要成分，可以从活体菌上缓慢释放，菌体破碎后大量释放到周围环境中6。LPS 是一种有效的免疫刺激剂，也是机体天然免疫系统识别的主要靶分子，它通过持续刺激机体细胞系统，可被宿主
11、脂多糖结构识别受体（如信号识别受体 TOIL 样受体 4，TLR4）识别，从而激活一系列信号转导通路，激发免疫应答，诱导细胞因子（如 IL-1、TNF- 等）的转录表达，产生炎症级联反应。实验已证明，LPS 可诱导单核细胞、巨噬细胞、B 细胞等多种细胞产生炎症反应7。本实验据此建立免疫炎症模型8，探讨中药妍婷颗粒免疫调节、抗炎治疗的机理和有效性。细胞因子是一种由细胞产生的，具有调节细胞功能的高活性、多功能的蛋白质多肽分子，其功能为调控细胞增殖、生长、分化和代谢活动9。白介素-1（IL-1）不仅作为一种重要的细胞因子，是体内调节免疫和炎症反应的中心介质，也作为神经递质和生长因子参与机体多个系统的
12、病理生理活动。近年对 IL-1 的研究日益深入，其在各系统中的作用与机制得到相应证实，为一些临床疾病的诊治提供了有力依据。IL-1 主要由淋巴细胞、单核巨噬细胞产生，B 细胞、单核巨噬细胞在LPS 等刺激剂作用后，合成和分泌大量 IL-1（主要是 IL-1 为主）10。IL-1 被称为前炎症因子11，机体受到感染或创伤时，由淋巴细胞、单核巨噬细胞最早产生的细胞因子 IL-1，启动炎症级联反应，刺激体内多种细胞产生各种趋化因子（如补体片断 C5a，白细胞三烯 LTB4，中性阳离子蛋白），促进多种免疫分子（如 TNF-，黏附分子等）基因表达和中性粒细胞释放炎症蛋白、炎症介质（如组胺、缓激肽、前列腺
13、素），这些细胞因子在慢性盆腔炎的发生发展中起着重要作用。中医学认为慢性盆腔炎的发生多由于经期、产后摄生不慎，感受湿、热、寒邪乘虚客于冲任、胞宫，邪正交争，气血运行不畅，搏结成瘀所致，血瘀气滞是本病6发病关键，中医药在治疗慢性盆腔炎方面有副作用小、疗效高的优势。妍婷颗粒方为导师侯丽辉教授治疗慢性盆腔炎的经验方。方中赤芍、丹参清热凉血，活血祛瘀，调经止痛；延胡索、三棱、莪术、川芎共奏活血散瘀，行气消积止痛之功；红藤、败酱清热解毒，活血止痛；皂角刺托毒排脓，活血消肿。诸药合用，共同达到行气活血，化瘀通络止痛的作用，抑制免疫炎症因子 IL-1 的释放。现代药理研究证明12，妍婷颗粒方组成药物具有抗菌、
14、抗炎、改善血液流变性、抑制结缔组织增生，使纤维溶解，抑制凝血，增强免疫的作用。本实验结果也表明，妍婷颗粒具有抑制免疫炎症因子 IL-1 合成和释放的功效,至于其调节免疫、抑制炎症反应的具体环节有待于进一步研究。【参考文献】1 张玉环，陈保疆，王 萍,等.健脾补肾方含药血清对体外培养小鼠脾细胞周期影响J.天津中医药，2006，23（1)：51.2 刘永平，管茶香，白洪波,等.降钙素基因相关肽对 LPS 诱导肺泡巨噬细胞分泌 MMP-9 的影响J.中国应用生理学杂志，2007，23（2）：211.3 杨明炜,陆付耳,李鸣真,等.热毒清对内毒素体内、外诱生肿瘤坏死因子的影响J.中国中医基础医学杂志，
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