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1、1五味子水溶性多糖提取及纯化工艺的优 化作者：姜波，孙静，刘春，范圣第【摘要】 目的研究五味子多糖提取工艺参数及参数的评价方法。方法用水提取醇沉法提取五味子多糖，通过单因素及正交实验，研究固液比、提取温度、提取时间及提取次数对五味子多糖得率的影响，并对多糖得率的质量评价和含量评价方法进行探讨，同时进行了多糖的纯化研究。结果提取温度对五味子多糖得率的影响最大，固液比、提取时间对五味子多糖得率影响较小。通过测定提取的多糖含量计算五味子多糖得率与单纯用多糖质量（所得沉淀）计算的五味子多糖得率的比较存在一定的差异，表明采用含量测定的方法比单纯的质量比所确立的条件更准确。结论五味子多糖提取的最佳工艺条件
2、为：固液比 130，提取温度 90，提取时间 4 h，提取 3 次。用活性炭与 Sevage 法联合使用纯化多糖，使提取的多糖纯度由43.48%提高到 66.43%。 【关键词】 五味子 多糖 提取 纯化五味子为木兰科植物五味子的果实，因其甘、酸、辛、苦、咸五味俱全，故得名五味子。五味子是名贵中药材， 本草纲目中记载，五味子益气主治，咳逆上气，劳伤羸瘦，补不足，强阴，养五脏，除热，止呕逆，补虚劳，明目，壮筋骨，除烦热，解酒毒，生津止渴，补元气不足等1。临床多用于久咳虚喘、津亏口渴、遗精、自汗、久泻、神经衰弱、肝炎等症2。近年来通过大量动物和临床实验发现，五味子还具有保肝、抗衰老、耐缺氧、增强机
3、体免疫力等活性2，3。2近年来研究发现活性多糖具有抗肿瘤、抗病毒、增强免疫力、延缓衰老、降血脂、降血糖、解毒、抗辐射等功效48，其作用日益受到人们的重视。本文利用对环境无污染的水提取的方法，研究了五味子多糖的提取工艺条件，并进行了粗多糖的纯化及多糖含量的测定。在人们常采用的通过依据提取多糖质量的多少（所得的多糖沉淀的质量除以样品的质量）来判断提取工艺条件911的同时，本文又通过测定提取的多糖中的多糖含量（测得的多糖含量乘以提取多糖质量除以五味子的质量）来选择多糖的提取条件，并将两种方法进行了比较。实验结果表明，采用含量测定的方法比单纯的质量比所确立的最佳条件更可靠。1 仪器与材料1.1 仪器与
4、试剂WFJ2100 型分光光度计（上海尤尼柯仪器有限公司），UV-9200 紫外-可见分光光度计（北京瑞利分析仪器公司），微型植物试样粉碎机（天津市泰新特仪器有限公司），电子分析天平（上海奥豪斯公司），恒温水浴锅（金北得工贸有限公司），TDL80-28 台式离心机（上海安亭精密仪器厂），电热恒温干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）。试剂均为国产分析纯。1.2 材料五味子：市购。2 方法2.1 材料的预处理3将五味子在 65烘箱中烘干后用粉碎机粉碎，过 80 目筛，于棕色磨口瓶中存放备用。2.2 五味子粗多糖提取方法称取一定量的五味子粉于具塞三角瓶中，按实验的设计加入一定量的蒸馏水，放入水浴中按一
5、定的温度浸提。冷却后，以 4 000 r/min 离心 20 min，所得提取液浓缩至原体积的约 1/5，然后加入 5 倍体积的乙醇，摇匀后，在 4冰箱中放置 24 h，以 4 200 r/min 离心 18 min。所得沉淀蒸干乙醇后，在 70烘箱中烘至干燥，所得固体即为五味子多糖。2.3 粗多糖的纯化方法五味子预处理蒸馏水浸提离心浓缩Sevage 法脱蛋白活性炭脱色醇沉离心干燥研磨干燥检测。质量比多糖得率（%）=提取的多糖质量五味子试样质量100%为了便于区分这个得率以下称为质量比多糖得率。2.4 多糖的含量测定方法采用硫酸-苯酚法，用葡萄糖作为标准测定多糖含量。标准溶液的配制及测定：准确
6、称取 0.10 000 g 已干燥的标准葡萄糖，溶解后至100 ml 容量瓶，用蒸馏水稀释到刻度。用移液管分别取上述配制的葡萄糖标准溶液 1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 ml，转移至 100 ml 容量瓶，并用蒸馏水稀释至刻度，摇匀。得浓度分别为 10，20，30，40，50g/ml 的葡萄糖标准溶液。从上述已配制的葡萄糖标准溶液中分别取出 0.6 ml 于 10 ml 具塞试管中，再4分别加入 5苯酚（W/V）溶液 1.2 ml，迅速加入浓硫酸 4.0 ml，摇匀，室温静置 15 min,30水浴中放置 15 min，在 486 nm 下测其吸光度。样品溶液的配制及测定：准确称取 0
7、.01g 粗多糖，用蒸馏水溶解后，分别转移至 50 ml 容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀。用与标样测定相同的方法测定样品中多糖含量。通过标准曲线测得样品浓度后带入以下公式可得到 0.01 g 粗多糖中多糖含量，再乘以粗多糖干燥后产量可得到 2 g 五味子中粗多糖量，最终可算出五味子多糖得率。多糖含量（%）=样品浓度稀释倍数样品体积多糖试样质量100%五味子多糖得率（%）=粗多糖多糖含量粗多糖质量五味子试样质量（2 g）100%2.5 单因素实验固液比(m/v)选用 110，120，130，140，150 五个条件，提取温度采用 75，80，85，90，95 5 个条件，提取时间为 1，2，
8、3，4，5 h 5 个条件，提取次数为 5 次。2.6 正交实验选 L9（33）正交实验，以确定五味子中水溶性多糖提取的最佳工艺参数。水平因素见表 1。表 1 水平因素（略）3 结果与讨论3.1 多糖含量的测定经紫外光谱扫描确立多糖测定的最大吸收为 486 nm，测得的葡萄糖标准曲线的相关系数为 0.999 6，线性方程为 Y=0.006 9X。53.2 五味子多糖提取的单因素实验研究为了更准确地反映出提取多糖的量，本文除了采用人们普遍使用的直接利用提取的多糖质量与试样质量之比的多糖得率计算方法来考察因素外，还利用定量分析提取的多糖中的多糖含量，继而换算出五味子试样中多糖得率的方法来指示各因素
9、提取多糖的多寡，进而指示各因素的优劣。这样可以避免提取的多糖质量高，即提取的多糖质量与样品质量之比的多糖得率高但多糖含量不一定高的问题。同时也可以说明有的文献中出现的异常数据，使各因素考查的结果更具可信性。3.2.1 固液比对多糖得率的影响在提取温度为 80，提取时间为 3h 条件下，进行固液比实验。结果见图 1。实验结果表明，随着固液比的增加，多糖得率逐渐增加，但当固液比达到 140后，质量比多糖得率却有所下降，但经过多糖含量测定计算的五味子多糖得率逐渐上升，由此可以看出单凭由质量比多糖得率来确立提取条件的不准确。这同时也说明了一些研究中随着固液比的增大，多糖得率反而减小的现象。由图 1 可
10、以看出，当固液比达到 30以后，五味子多糖得率增加缓慢。 3.2.2 提取温度对多糖得率的影响在固液比为 130，提取时间为 3 h 条件下，进行提取温度实验。结果见图 2。由图 2 可以看出，在所选的 5 个提取温度下，随着温度的升高，多糖的提取率随之升高，到达 90时最大，而当温度 95时提取率下降，这可能是由于在较高温度下提取使大分子多糖的糖苷键断裂造成了多糖的部分损失。提取温度考虑为690。质量比多糖得率与五味子多糖得率随温度变化趋势基本一致。3.2.3 提取时间对多糖得率的影响在固液比为 130，提取温度为 90条件下，进行提取时间实验。结果见图 3。由图 3 可看出随提取时间的增加
11、多糖得率增加，到 3 h 后增加幅度缓慢。五味子多糖得率随时间增加缓慢增加，而质量比多糖得率当提取时间为 5 h 略有降低。3.2.4 提取次数对多糖得率的影响在固液比为 130，提取温度为 90条件下，提取时间为 3h 条件下，进行 5 次提取次数实验。结果见图 4。由图 4 可见，第 1 次提取多糖的得率最高，第 2 次次之，第 3 次以后多糖得率较小，实验提取次数 3 次为宜。质量比多糖得率与五味子多糖得率随温度变化趋势基本一致。3.3 五味子多糖提取的正交实验在单因素实验的基础上，选定 3 因素 3 水平正交实验。结果见表 23。表 2 正交实验 L9 （33）结果，表 3 正交实验方
12、差分析（略）。比较 3 个因素的极差 R 值，RBRARC，可看出温度对提取多糖得率影响最大，其次为固液比，最后为浸提时间。最佳工艺组合为 A2B2C3，即固液比为130，温度为 90，提取时间为 4 h。在此最佳提取条件下提取，得每 2 g 五味子多糖高达到 69.39 mg，五味子多糖得率为 3.470。73.4 多糖的纯化采用活性炭与 Sevage 法联合纯化多糖。首先用活性炭处理。将提取液在水浴中加热至 90，活性炭与提取液按 15（W/V）量加入，搅拌 30 min，过滤，用蒸馏水洗涤活性炭层 4 次，合并滤液后，浓缩。然后用 Sevage 法脱蛋白，氯仿正丁醇比例为 41（V/V）
13、，与提取液的比例为 15（V/V），用力振摇30min，4 200 r/min 离心 15 min。醇沉后，得到精制多糖。3.4.1 活性炭处理实验结果用紫外光谱在 280 nm 下测定多糖提取液的紫外吸收，活性炭处理前后的吸光度见图 5。由图 5 可见，活性炭处理除掉了大部分的杂质。3.4.2 Sevage 法脱蛋白用 Sevage 法除蛋白，共做了 5 次，每次去除蛋白情况见图 6。由图 6 中可看出蛋白质含量在经过 1 次 Sevage 处理后的吸光度有所减少，但随着处理次数的增加，差异不明显。说明多糖中的大部分游离蛋白已去除，多糖中可能存在结合蛋白而不能单独去除。3.4.3 纯化后多糖
14、含量在优化后的最佳条件下提取的多糖用硫酸-苯酚法测得其糖中多糖含量为 43.48%，纯化后的多糖含量为 66.43%。4 结论在提取水溶性多糖过程中，因素水平对五味子多糖得率的影响顺序为温度固液比提取时间。多糖提取的最佳工艺条件为固液比为 130，温度为 90，提8取时间为 4 h，提取 3 次。用硫酸苯酚法测定多糖含量，加硫酸后立即摇匀，室温静置 15 min,30放置水浴 15 min。在 486 nm 下测其吸光度。显色稳定，标准曲线的相关系数为0.999 6。通过测定提取多糖中的多糖含量换算出五味子试样中多糖得率的方法来指示各因素提取多糖的多寡，比用单纯的质量比考察各因素的结果更具可信
15、性。通过活性炭与 Sevage 法联合使用纯化多糖，使提取的多糖纯度由 43.48提高到 66.43。【参考文献】1明李时珍.本草纲目(校点本第二版)（下册）M.北京：人民卫生出版社，2005：1238.2刘晓瑞.北五味子抗衰老作用的研究J.中国老年学杂志，2005,25(12):1562.3李晓光，高勤，翁文，等.五味子有效部位及其药理作用研究进展J.中草药，2005,28（2）：156.4韩果萍, 段玉峰. 我国天然活性多糖药理研究进展J. 中药材, 2003,26(2):138.5韦巍, 李雪华. 多糖的研究进展J. 国外医学药学分册, 2005,32(3):179.6常改, 杨溢, 霍飞, 等. 植物多糖的研究进展及保健功能J. 中国公共卫生, 2003,19(11):1394.7吴梧桐, 高美凤, 吴文俊. 多糖的抗肿瘤作用研究进展J. 中国天然药物, 2003,1(3):182.98王红英. 中药多糖研究进展J. 实用医技杂志, 2006,13(6):1021.9夏秀华,王海鸥.银杏叶多糖提取工艺研究J.食品研究与开发，2206,27(1):69.10刘春兰,邓义红,杨林，等,雪莲水溶性多糖提取工艺的研究J.食品与生物技术学报，2007,26(3):37.11陈发河,吴光斌,田标，等.中低档乌龙茶中茶多糖提取工艺优化J.农业工程学报,2006,22(12):245.
