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1、1人工虫草提取物对缺血心肌的保护作用 及其机制作者：韩冰，王泽君，王天，李紫，张雷明，刘珂【关键词】 人工虫草菌丝；,缺血；,心肌；,保护摘要：目的研究人工虫草提取物对缺血心肌的保护作用及其机制。 方法通过结扎大鼠左冠状动脉前降支（LAD）造成急性心肌缺血模型，观察人工虫草水提取物（Water extract from cultural mycelium,WE）、醇提取物（Ethanal extract from cultural mycelium,EE）、醋酸乙酯提取物(Ethyl acetate extract from cultural mycelium,EA)和石油醚提取物（Petro
2、leum ether extract from cultural mycelium,PE）对心肌梗死面积（MIS）、血清磷酸肌酸肌酶（CK-MB）、乳酸脱氢酶（LDH）、丙二醛（MDA）、一氧化氮（NO）、一氧化氮合酶（NOS）及超氧化物歧化酶（SOD）的影响。结果 WE，EE 和 PE 可明显减小 MIS，降低 CK-MB 及 LDH 活性，减少 MDA含量，增高 NO 含量，提高 NOS 和 SOD 活性。结论 WE，EE 和 PE 对缺血心肌具有保护作用，其机制与 WE，EE 和 PE 提高 NOS 和 SOD 活性从而扩张冠状动脉和抗脂质过氧化有关。关键词：人工虫草菌丝； 缺血； 心肌
3、； 保护Abstract：ObjectiveTo evaluate the effects of extracts from cultural mycelium of Cordyceps sinensis on myocardial infarction and explore the possible mechanisms involved in it. MethodsRats were treated with water extract from cultural mycelium（WE）,ethanal extract from cultural mycelium（EE）,ethyl
4、acetate extract from cultural mycelium (EA) and petroleum ether extract from cultural mycelium（PE） for 7 days before myocardial infarction induced by coronary occlusion. The myocardial infarct size(MIS), creatine phosphokinase(CKMB) activity, lactate dehydrogenase(LDH) activity, nitric oxide (NO) co
5、ntent, malondial dehyde(MDA) 2content， nitric oxide synthase (NOS) and superoside dismutase (SOD) activity were measured.ResultsWE，EE and EA significantly reduced MIS, exerted notable inhibition in the elevation of CK-MB activity, LDH activity and MDA content, markedly increased NO level, NOS and SO
6、D activities. ConclusionThe results indicated that WE, EE and EA showed a capacity to resist ischemic damage and the mechanisms were correlated with mediating NOS and SOD activity at least, in part.Key words：Cultural mycelium of Cordyceps sinensis; Ischemic; Cardiocytes; Protection冬虫夏草 Cordyceps sin
7、ensis 是我国的传统中药，为麦角菌寄生在蝙蝠蛾幼虫上的干燥子座和虫体，其性味甘平，具补肺益肾、止血化痰之功效。由于冬虫夏草产地局限，产量稀少，现多用人工培养品，人工培养的冬虫夏草称为虫草菌丝体或简称虫草。冬虫夏草富含多种氨基酸、多糖、有机酸、微量元素、核苷、肽类和甾醇等多种化学成分，药理作用广泛，对心血管系统、免疫系统和中枢神经系统等都有调节作用。近年来，有关虫草对心血管系统作用的研究表明，虫草有明显降压及负性频率作用1，2；清除自由基作用3，4和抗心律失常作用5等，但有关人工虫草提取物对心肌缺血损伤的影响尚未见报道。因此本文通过结扎大鼠左冠状动脉前降支造成急性心肌缺血模型，观察了人工虫草
8、水提取物、醇提取物、醋酸乙酯提取物和石油醚提取物对缺血心肌的影响并对其作用机制进行了探讨。1 器材1.1 动物 Wistar 大鼠，雄性，体重 250 300 g，山东绿叶天然药物研究开发有限公司实验动物中心提供。合格证号 200106005。1.2 药品与试剂人工虫草水提取物（WE）、醇提取物（EE）、乙酸乙酯提取物(EA)、石油醚提取物（PE）,由山东绿叶天然药物研究开发有限公司提供；复方丹参片，山东省东营仙河制药厂，批号 030937；氯化硝基四氮唑蓝（NBT），上海前进试3剂厂；血清磷酸肌酸肌酶（CK-MB）、乳酸脱氢酶（LDH）、丙二醛（MDA）、一氧化氮（NO）、一氧化氮合酶（NO
9、S）及超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒均购自南京建成生物工程公司。1.3 仪器 722E 型可见分光光度计，上海光谱仪器有限公司；TDL-40B 台式离心机上海安亭科学仪器厂。2 方法2.1 动物分组与给药 70 只雄性 Wistar 大鼠随机分成 7 组，每组 10 只。分别为假手术组（Sham）、心肌缺血模型组（Model）、复方丹参组(DS) 、人工虫草菌丝体水提取物组（WA）、醇提取物组（EE）、醋酸乙酯提取物组（EA）、石油醚提取物组（PE）。Sham 与 Model 给予羧甲基纤维素钠 100 mg/kg 灌胃，DS，WA，EE，EA和 PE 分别给予复方丹参 338 mg/kg，人
10、工虫草菌丝体水提取物 12 mg/kg，醇提取物 12 mg/kg，醋酸乙酯提取物 12 mg/kg，石油醚提取物 12 mg/kg 灌胃。灌胃 1 次/d，连续 7 d。2.2 心肌缺血模型建立6末次给药 1 h 后乌拉坦 1 000 mg/kg ip 麻醉大鼠，仰位固定于手术台上，自左侧 34 肋间开胸，暴露心脏，以 0 号线于肺动脉圆锥及左心耳间结扎冠状动脉左前降支，将心脏送回胸腔，挤出胸腔内血液和气体，迅速关闭胸腔，开胸时间不超过 30 s，假手术组仅置缝线而不结扎冠状动脉。24 h 后乌拉坦 1 000 mg/kg ip 麻醉大鼠，腹主动脉插管取血，离心（3 000 r/min，10
11、 min）分离得血清样品，按试剂盒操作说明测定血清中 CK-MB，LDH，NOS，SOD 活性及NO，MDA 含量；取血后立即打开大鼠胸腔，剪取心脏后用生理盐水洗净心腔内积血，去掉心房组织及脂肪，称重，将左心室心肌横切 4 片，然后浸入 0.1 % NBT 磷4酸缓冲液中，置 37 恒温水浴中 15 min，待染色完全后取出，正常心肌组织染色，缺血心肌组织不染色。切下缺血心肌称重，按下列公式计算心肌梗塞面积（MIS）MIS（%） = 缺血心肌重/左心室重100% 。2.3 统计学分析实验数据以s 表示，组间比较采用 t 检验进行统计分析。 3 结果3.1 人工虫草提取物对 MIS，CK-MB
12、和 LDH 的影响与模型组比较，DS，WE，EE 和 PE 均能显著减小心肌梗塞面积（P0.01 或 P0.05），抑制血清CK-MB 和 LDH 升高（P0.01 或 P0.05），但 EA 未见明显抗心肌缺血作用。结果见表 1。表 1 人工虫草提取物对 MIS，CK-MB 和 LDH 的影响（略）与假手术组比较，#P0.05,#P0.01；与模型组比较，*P0.05,*P0.01；n=103.2 人工虫草提取物对 SOD 和 MDA 的影响与模型组比较，DS，WE，EE 和PE 均能显著升高 SOD 活性（P0.05），降低 MDA 含量（P0.05）。结果见表 2。表 2 人工虫草提取物
13、对 SOD 和 MDA 的影响（略）与假手术组比较，#P0.05；与模型组比较，*P0.05；n=103.3 人工虫草提取物对 NOS 和 NO 的影响与假手术组比较，模型组 NOS 和NO 均未见明显变化；与模型组比较，DS，WE，EE 和 PE 均能显著升高 NOS 活性和 NO 含量（P0.01 或 P0.05）。见表 3。5表 3 人工虫草提取物对 NOS 和 NO 的影响（略）与模型组比较，*P0.05,*P0.01； 与模型组比较，*P0.05, *P0.01；n=104 讨论心肌缺血缺氧使细胞膜对 Ca2+的通透性增高，Ca2+内流增加，使胞浆 Ca2+浓度增高。Ca2+增多可抑
14、制线粒体功能，ATP 生成减少而加重细胞损伤；可激活磷脂酶，使细胞膜磷脂分解；使溶酶体膜磷脂分解而释放大量溶酶体酶，进而导致细胞及其周围组织溶解坏死。心肌缺血缺氧还通过交感神经兴奋和胞浆中 Ca2+浓度增高等途径产生大量活性氧和自由基，活性氧和自由基攻击细胞膜结构中的不饱和脂肪酸，引起脂质过氧化，将脂质降解为 MDA 等小分子7。心肌细胞内富含与代谢相关的酶，如 CK-MB 和 LDH 等，心肌细胞损伤或坏死后，CK-MB 和LDH 等酶将渗透进入血液。因此，血清中 CK-MB 和 LDH 的含量可反映心肌损伤和坏死的程度8。本实验结果表明，WE、 EE 和 PE 可明显减小 MIS 而且降低
15、了血清中 CK-MB 和 LDH 的含量，这充分说明 WE，EE 和 PE 对缺血心肌具有保护作用。为防御活性氧和自由基对组织细胞的损伤，机体存在清除各种活性氧和自由基的酶系统，如 SOD、过氧化酶和谷胱甘肽过氧化酶等。其中 SOD 被视为活性氧和自由基的第一防线。WE，EE 和 PE 明显升高了 SOD 活性，则使 SOD 清除活性氧和自由基的能力增加，降低细胞膜脂质过氧化，使 MDA 产生减少，从而保护缺血的心肌细胞。血氧供需失衡和血栓形成是心肌缺血的重要病理生理机制，因此，改善心肌的血氧供需矛盾与抗血栓是治疗心肌缺血的药理基础。NO 由 L-精氨酸在 NOS 作用下产生。NO 通过激活细
16、胞内鸟苷酸环化酶使 cGMP 水平升高，6从而产生广泛的生物学效应，包括扩张冠状动脉，抑制白细胞和血小板黏附，抑制内皮细胞凋亡等9，10。本实验结果表明：WE，EE 和 PE 增高 NOS 活性，进而产生 NO 扩张冠状动脉等生物效应，缓解心肌需氧与供氧的失衡，起到抗心肌缺血的作用。本研究通过结扎大鼠冠状动脉造成心肌缺血模型，证明 WE， EE 和PE 对缺血心肌具有保护作用，其机制与 WE， EE 和 PE 抑制脂质过氧化和扩张冠状动脉有关。本实验结果显示 EA 不具有抗心肌缺血作用，那么 EA 与 WE，EE和 PE 的成分有何不同，WE，EE 和 PE 中究竟是哪种成分具有抗心肌缺血作用，WE，EE 和 PE 是否还通过其他途径保护缺血心肌，这将是我们下一步深入研究和探讨的问题。参考文献：1 Liu C K. Recent progress in pharmacology of Cordyceps sinensis and Cultrual myceliumJ
