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1、1两种氟喹诺酮类药物对肺炎克雷伯菌防 耐药突变浓度及耐药突变体耐药性的研 究作者：邓晓慧 郑风劲 何文富 孙爱慧 刘小康【摘要】 目的 测定两种氟喹诺酮类药物(FQNs)对肺炎克雷伯菌(KP)的防耐药突变浓度(MPC)，比较其防耐药突变能力，了解突变耐药菌对 FQNs 的耐药性。方法 肉汤法富集 1010CFU/ml 的菌液接种于不同浓度环丙沙星及加替沙星琼脂平皿上，采用琼脂二倍稀释法测定环丙沙星、加替沙星对临床分离肺炎克雷伯菌ATCC700603 及其耐药突变体的最低抑菌浓度(MIC)、防耐药突变浓度(MPC)。对不同药物浓度筛选出的耐药突变株进行编码拓扑异构酶 VIC 亚单位基因 parC
2、 和回旋酶 A 亚单位基因 gyrA 喹诺酮耐药决定区的 PCR 扩增和测序，并测定外排泵抑制剂羟基氰氯苯腙(Carbonyl Cyanide m chlorophenylhydrazone，CCCP)对环丙沙星和加替沙星 MIC 的影响。结果 环丙沙星、加替沙星对 ATCC700603 的 MPC分别为 4、1.6mg/L，细菌耐药选择指数分别为 16、4。两种药物的耐药突变体均出现了 gyrA 的第 83 位(TCCATC/TTG)均出现了突变，引起了相应氨基酸的改变(Ser 83Ile/Leu)。其中有一株同时也出现了第 87 位点(GACAAC)的改变，氨基酸也由 AspAsn。除第二
3、步突变体 parC 第 80 位点突变(AGCATC)，引起氨基酸由 SerIle 的改变外，其余几株均没有发生 parC 的突变。MIC 测定结果显示，单用两种 FQNs 及合用 CCCP 的结果一样。结论 加替沙星限制 KP 耐药突变株选择的能力强于环丙沙星，KP 的耐药突变株对 FQNs 耐药的主要原因是 gyrA 和parC 基因突变。 2【关键词】 氟喹诺酮； 肺炎克雷伯菌； 耐药； 防耐药突变浓度ABSTRACT Objective To determine mutant prevention concentration (MPC) of two fluoroquinolones
4、for Klebsiella pneumoniae (KP) and compare the capacity of fluoroquinolones to prevent the resistant mutant strains. Methods The KP strain ATCC700603 was enriched in broth, and the bacterial concentrations were adjusted to 1010 colony forming units per milliliter. The minimal inhibitory concentratio
5、n (MIC) and MPC of gatifloxacin and ciprofloxacin for KP were determined by agar plates dilution method. Quinolone resistance deternining region (QRDR) of parC and gyrA genes were identified by PCR amplification and gene sequencing. The effect of efflux pump inhibitor CCCP on MICs of gatifloxacin an
6、d ciprofloxacin for resistant mutants was determided by agar dilution method. Results The MPC of gatifloxacin and ciprofloxacin for KP strain ATCC700603 were 1.6 and 4mg/L, and the MPC/MIC were 4 and 16 respectively. The all strains had an TCCATC or TCCTTG mutation in codon 83, leading to amino acid
7、 change: SerLeu or SerIle. At the same time, a GACAAC mutation was found in codon 87 which resulted in amino acid change: AspAsn. Except for the second step mutant, DNA sequencing analysis of parC did not reveal point mutation (AGCATC) leading the substitution of a Ile for Ser in 4 strains. As for t
8、he MICs, of which the two fluoroquinolones withCCCP were same as the MICs without CCCP. Conclusions The capacity of gatifloxacin for restricting the selection of KP resistant mutants is stronger than that of ciprofloxacin. The mutation of gyrA and parC genes are the primary mechanisms responsing for
9、 resistance of Klebsiela pneumoniae to FQNs.KEY WORDS Fluoroquinolones; Klebsiella pneunoniae; Drug resistance; Mutant prevention concentration肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneunoniae，KP)是兼性厌氧的革兰阴性菌，通常存在于人类肠道及呼吸道，是目前重要的条件致病菌，其发病率1仅次于大肠埃希菌和铜绿假单胞菌。氟喹诺酮类药物(FQNs)是治疗 KP 感染的常用药，由于其广泛应用，KP 对其耐药性逐年递增。目前，就新一代 FQNs 的耐药性及
10、延长其临床使用寿命，国外学者 Drlica 提出了防耐药突变浓度(mutant prevention concentration，MPC)这一概念2，该理论在关注抗菌药物预防细菌耐药变异的同时，对临床医师的用药也起到了重要的作用。关于 MPC 的研究国内已经开始，但尚未见对 KP 的报道。本实验测定了环丙沙星(CPLX)和加替沙星(GTLX)对 KP 的3防耐药突变浓度及耐药突变株对二者的敏感性，以期为临床合理应用 FQNs 药物提供参考。1 材料1.1 菌株受试菌 15 株，肺炎克雷伯菌 ATCC700603(本实验室保存)，14 株临床分离菌分别来自华西一附院、四川省二院、宜宾市第一人民医
11、院 2006 年 6 月8 月临床分离的对环丙沙星敏感菌。1.2 抗菌药物环丙沙星(CPLX 广州南新制药有限公司，批号 CFI02706)、加替沙星(GTLX 浙江亚太药业股份有限公司，批号 060206)和羟基氰氯苯腙(Carbonyl Cyanide m chlorophenylhydrazone，CCCP，美国 Sigma 公司)。1.3 试剂及仪器Muller Hinton(MH)肉汤、MH 琼脂、LB 肉汤(杭州天和微生物试剂有限公司)。Taq 酶和 dNTP(大连宝生物工程有限公司)；DNA 纯化试剂盒(北京天为时代)；SDS、EDTA、饱和酚、氯仿、Tris、EB、琼脂糖(博瑞
12、克生物科技有限公司)、高速台式离心机(美国 Sigma 公司)、DYY 6B 型稳压稳流电泳仪(北京市六一仪器厂)、PCR 扩增议(eppendorf)、凝胶成像议(冷泉港生物科技有限公司)。2 方法2.1 MIC 测定及两种 FQNs 药物联合 CCCP 对耐药突变株的 MIC 测定参照文献3推荐的琼脂二倍稀释法测定 CPLX 和 GTLX 对临床分离4KP、ATCC700603 及不同耐药突变株的 MIC，在测定 MIC 的同时，制备含有泵抑制剂 CCCP 的平板(CCCP 终浓度为 20mg/L)，与 CCCP 联用的 FQNs 的 MIC 比单用 FQNs 的 MIC 降低 4 倍说明
13、有主动外排机制存在，用大肠埃希 S 菌ATCC25922 作为质控菌。判断按照参考文献3标准。2.2 防耐药突变浓度(MPC)的测定将 CPLX 和 GTLX 倍比稀释成不同的浓度，药液和 MH 琼脂培养基按 19 的比例在 90mm 的平板中混匀，配制成浓度高于 MIC 的系列浓度二倍稀释的含药平板，每个浓度 4 个平板，置 37孵箱过夜。菌液制备参照文献 Zhao4的方法，单个菌落过夜培养后集菌，把菌液调至 1010CFU/ml，取 100l 均匀地涂在制备好的含药平板上，孵育 24、48 和 72h 后观察结果，以不出现细菌生长的最低药物浓度为该药对这种细菌的 MPC 值。2.3 菌落恢
14、复生长比率曲线的绘制按照 2.2 集菌方法集菌后，将 1010CFU/ml 的菌液倍比稀释成不同浓度至103CFU/ml，将不同浓度菌液 100l 涂在含抗菌药物平板上，计数恢复生长菌落数及恢复生长比率，描绘生长比率曲线。2.4 GTLX 和 CPLX 对 ATCC700603 耐药突变株的选择及其基因组 DNA 的提取按照上述 2.2 方法集菌后，将 100l 的菌液接种于含 2MICMPC 不同浓度的抗菌药物平皿上，37培养 4872h，挑取不同浓度平板上生长的菌落，将这些菌落培养 2 代后接种于原药物浓度的平板上如仍然生长即为耐药突变株，1、2 步耐药5突变株均按照此方法选择。筛选出的耐
15、药突变株用碱裂解法提取基因组 DNA，做为 PCR 的 DNA 模板。2.5 耐药突变株 gyrA 基因和 parC 基因的扩增及测序使用 Primer 5.0 设计引物，gyrA 正向引物为5 TGCGAGAGAAATTACACC 3，反向引物为5 AATATGTTCCATCAGCCC 3扩增片段长度为 625bp；parC：正向引物为5 CCAGCGTCGCATC GTCTA 3，反向引物为5 AAAGTTTGGCACCCAGTCG 3，扩增片段长度为 319bp。扩增条件：反应体系为 50l，94预变性 3min，循环参数为变性 94 30s，退火 gyrA 为 50 30s，parC
16、为 54 30s，延伸 gyrA 为 72 30s，parC 为 72 30s，35 个循环，72延伸 10min。扩增产物经含 EB 的 1%琼脂糖凝胶电泳后照像(图 1)。PCR 产物按照产物纯化试剂盒纯化后委托上海英骏公司测序。 3 结果3.1 GTLX 和 CPLX 对 KP 临床分离株、ATCC700603 及其耐药突变体的MPC、MIC两种药物对 ATCC700603 的 MIC 值：GTLXN：空白对照； M：DNAmarker；16：分别为耐药突变体 gyrA、parC 基因扩增产物图 1 gyrA 基因扩增产物电泳图(0.4g/ml)CPLX(0.25g/ml)，MPC 值：CPLX(8g/ml)GLXT(1.6g/ml)，选择指数(MPC/MIC)：GTLX(4) 63.2 GLXT 和 CPLX 对临床分离株的 MPC 及 MIC 值90%菌株的 MIC 显示 GTLX 的 MIC 值大于 CPLX，MPC 值小于 C
