《PI-103对多药耐药白血病细胞体外作用的研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《PI-103对多药耐药白血病细胞体外作用的研究（3页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1PI-103 对多药耐药白血病细胞体外作用 的研究【摘要】目的研究 PI-103 对耐药白血病细胞的效果及其机制。方法四甲基偶氮唑蓝（MTT）法研究 PI-103 对 K562 及 K562/A02 细胞增殖的影响，流式细胞术研究细胞内阿霉素浓度的改变。结果 PI-103 能显著抑制两种细胞株的生长，对敏感和耐药白血病细胞株具有相同的抑制效果；PI-103 能显著增加细胞内阿霉素的浓度，与阿霉素联用时，能增加阿霉素对细胞的生长抑制作用，但仅有叠加效应而无协同效应。结论 PI-103 对于耐药白血病是一种有良好应用前景的药物。 【关键词】白血病多药耐药 PI-103 多药耐药是急性白血病治疗失
2、败的主要原因，其主要机制是 P-糖蛋白（Pgp）高表达，将细胞内的化疗药物“泵”出细胞外，导致细胞内药物浓度过低，使白血病细胞呈现出耐药表型。如何绕过 Pgp 的泵作用，逆转耐药，提高白血病的治疗效果是当前治疗的重要方向。K562/A02 是由 K562 细胞经长期阿霉素诱导和克隆筛选而建立的一个耐药细胞系1，能在 2g/ml 阿霉素中长期生存，对阿霉素的耐药指数在 10 以上。它高表达 Pgp，是体外研究多药耐药的一个较好的细胞模型。 PI-103 是一种人工合成的 PI3K 和 mTOR 特异性抑制剂。PI3K 和 mTOR 是PI3K/AKT/mTOR 信号转导途径的重要成员，该信号途径
3、在肿瘤的发生发展中发挥着重要的作用。近年来发现 PI-103 对黑色素瘤2、肺癌3、神经肿瘤4等多种肿瘤具有抑制作用，显示了较好的抗肿瘤效果。本研究旨在研究它对多药耐药白血病细胞株 K562/A02 的作用。 1 材料和方法 1.1 细胞株及培养条件 K562 及 K562/A02 细胞株由浙江大学医学院第一附属医院2血液病研究所传代保存。培养基为含 10%胎牛血清的 RPMI1640（Gibco 公司产品），置 37、5%CO2、饱和湿度培养箱中培养，K562/A02 长期以 2g/ml 阿霉素（ADM）加压培养，在实验前 2 周撤除阿霉素。取对数生长期的细胞进行实验。PI-103 购自美国
4、 cayman 公司。 1.2MTT 法测定细胞增殖：取对数生长期细胞，调整细胞浓度，以 1105 个细胞/ml的终浓度接种于 96 孔培养板，加入不同浓度药物，空白对照组以培养基补足，每孔总体系 0.2ml，CO2 孵箱内培养 24 小时（h），加 MTT 工作液 20l/孔（美国Sigma 公司），置 CO2 培养箱中孵育 4h，1000rpm/min 离心，小心吸去上清，加入二甲基亚砜 0.2ml/孔，吹打，使紫蓝色甲臜沉淀充分溶解。在酶标仪 570nm 波长处读取吸光度值（A）。以时间为横轴，A 值为纵轴，绘制细胞生长曲线。实验重复三次，设复孔三个，取平均值为最终结果。按下列公式计算细
5、胞增殖率： 细胞生存率=（A 处理组-A 空白组）/（A 对照组-A 空白组）*100% 细胞生长抑制率=1-细胞生存率 1.3 流式细胞术测定细胞内阿霉素浓度：将 0.2M 的 PI-103 和/或 2g/ml 阿霉素与终浓度为 1105/ml 的细胞共同孵育 24 小时，收集 15105 个细胞，1000rpm离心 5min，弃上清。加入适量冷 PBS，细胞重悬，1000rpm 离心 5min，重复 2 次。以冷 PBS 重悬细胞，上机行流式细胞检测。流式检测激发波长 488nm，接收波长575nm。细胞内阿霉素浓度高低以荧光强度为计量单位。 1.4 统计学处理采用 t 检验，所有数据经
6、SPSS11.5 统计软件分析。 2 结果 2.1PI-103 对敏感和耐药细胞株的生长抑制作用相同 我们用 MTT 法检测了不同浓度 PI-103 对 K562 及 K562/A02 细胞增殖的抑制作用。0.5-5M 的 PI-103 处理 24h 后，两种细胞均呈现出明显的细胞生长受抑。而且，3细胞的生长抑制呈现出剂量依赖性。此外，在相同浓度的 PI-103 作用下，两种细胞株的生长抑制率基本相同，差异无统计学意义（P0.05)。 2.2PI-103 能增加白血病细胞株对阿霉素的敏感性，但仅有叠加作用 为进一步了解 PI-103 与阿霉素是否具有协同抑制白血病细胞增殖作用，我们用0.2MP
7、I-103 与不同浓度阿霉素联合作用于 K562 细胞及 K562/A02 细胞，以MTT 法观察了药物联用对两细胞的生长抑制效果。结果显示，0.2MPI-103 对K562 及 K562/A02 细胞的抑制率分别为 10.5%和 16.4%，加用 PI-103 后，阿霉素对 K562 细胞的抑制率有所增加，但单用阿霉素组的生长抑制曲线与联用 PI-103组的生长抑制曲线几乎平行，说明 PI-103 联用阿霉素仅有叠加作用，而无协调作用。同样，在 K562/A02 组，但单用阿霉素组的生长抑制曲线与联用 PI-103 组的生长抑制曲线几乎平行。说明 PI-103 联用阿霉素对 K562/A02
8、 细胞生长抑制作用也仅有叠加作用，而无协同作用。 2.3PI-103 能增加耐药细胞株细胞内阿霉素的浓度 为明确 PI-103 增加细胞对阿霉素敏感性的机制，本实验采用用流式细胞术检测了细胞内阿霉素的浓度。 结果显示，在 K562 组，未用 PI-103 时，细胞内阿霉素荧光强度为 87.463.46，PI-103 处理后，细胞内荧光强度升高为 107.316.13，差异具有统计学意义（P=0.015）。而在 K562/A02 组，PI-103 使细胞内阿霉素荧光强度由 79.092.97 升高至165.946.58，差异具有显著统计学意义（P=0.000）。结果显示 PI-103 能显著增加
9、细胞内阿霉素的浓度，尤其是在耐药 K562/A02 细胞中更明显。 3 讨论 PI3K/AKT/mTOR 信号转导途径是细胞生存和增殖的重要途径，在白血病多药耐药的形成机制中也发挥了重要作用。因而，通过抑制 PI3K 途径诱导细胞凋亡达到4治疗白血病尤其是耐药白血病的目的是一个较好的治疗思路5。本研究结果显示，双向抑制剂 PI-103 能显著抑制白血病细胞的增殖，且不受耐药细胞表型的影响，在耐药细胞及不耐药细胞中发挥同样的抑制生长作用。PI3K/AKT/mTOR 信号转导途径抑制剂是一种有良好应用前景的药物。 本研究发现，在 Pgp 高表达的细胞株 K562/A02 中，PI-103 能明显提
10、高细胞内阿霉素的浓度，其增加量明显高于敏感株 K562。其机制可能是由于 Pgp 的合成受抑制导致的。Tazzari 等报道6，多药耐药蛋白 P170 的表达是受 PI3K/AKT/mTOR信号调控的。Pgp 合成减少导致阿霉素被“泵”出减少，细胞内阿霉素浓度提高，从而在一定程度上逆转白血病细胞的耐药。 由 PI-103 能提高细胞内阿霉素浓度这一结果，作者推论 PI-103 与阿霉素有联用有协同作用。但令作者感到意外的是，本结果显示，二者联用仅有叠加作用，而无协同作用。这可能与下列原因有关：首先，可能与实验方法的选择有关。本实验采用 MTT 法研究药物作用后细胞的增殖，结果显示，在 2g/m
11、l 阿霉素作用下，K562/A02 细胞生长显著被抑制。然而，K562/A02 细胞是长期用含 2g/ml 的培养基中生长的，仅在实验前 2 周开始撤除阿霉素培养，因而，该细胞在 2g/ml 阿霉素作用下是不会死亡的，只是细胞的生长速度减慢了，细胞并未发生凋亡。联用 PI-103 后，尽管 K562/A02 细胞的生长受抑率仅仅是两药的叠加，但细胞凋亡是否有增加，尚不明确，换用流式细胞术检测细胞凋亡率也许有助于得出更确切的结论。其次，是否有其他耐药机制的参与，拮抗了细胞内阿霉素浓度提高所致的杀细胞效应，尚有待进一步的研究。第三，与K562/A02 细胞的特性有关。Kojima 等7发现，在野生
12、型 P53 存在的白血病细胞中，PI-103 与阿霉素有协同作用，而在 P53 突变的白血病细胞，则无协同效果。以往研究显示，K562 细胞存在 P53 突变，因而，PI-103 和阿霉素在 K562 及其耐药5株 K562/A02 中无协同杀伤白血病细胞的作用。然而，多数白血病原代细胞不存在 P53 突变。因而，体内应用于病人时，PI-103 可能会与阿霉素产生协同效应。 总之，在体外，PI-103 具有抗白血病细胞作用，对敏感和耐药细胞同样有效；它能增加细胞内阿霉素浓度，增加细胞对阿霉素的敏感性。双效 PI3K/AKT/mTOR 抑制剂是一种有良好应用前景的药物，对 PI-103 的深入研
13、究，必将为开发研制新的双效 PI3K/AKT/mTOR 抑制剂奠定坚实的基础。 参考文献 1LuanFJ.Establishmentofthemultidrug-resistantcelllineK562/A02anditsdrug- resistantproperties.ZhonghuazhongliuzazhiChinesejournalofoncology.1993Mar;15(2): 101-3. 2Lopez-FauquedM,GilR,GruesoJ,Hernandez- LosaJ,PujolA,MolineT,etal.ThedualPI3K/mTORinhibitorPI-
14、 103promotesimmunosuppression,invivotumorgrowthandincreasessurvivalofsorafenib- treatedmelanomacells.Internationaljournalofcancer.Apr1;126(7):1549-61. 3ZouZQ,ZhangXH,WangF,ShenQJ,XuJ,ZhangLN,etal.AnoveldualPI3Kalpha/mTOR inhibitorPI-103withhighantitumoractivityinnon- smallcelllungcancercells.Interna
15、tionaljournalofmolecularmedicine.2009Jul;24(1):97- 101. 4SchwabJ,AntonescuC,BolandP,HealeyJ,RosenbergA,NielsenP,etal.CombinationofP I3K/mTORinhibitiondemonstratesefficacyinhumanchordoma.Anticancerresearch.2009 Jun;29(6):1867-71. 5MartelliAM,TazzariPL,EvangelistiC,ChiariniF,BlalockWL,BilliAM,etal.Tar
16、getingt hephosphatidylinositol3- kinase/Akt/mammaliantargetofrapamycinmoduleforacutemyelogenousleukemiatherapy:f rombenchtobedside.Currentmedicinalchemistry.2007;14(19):2009-23. 6TazzariPL,CappelliniA,RicciF,EvangelistiC,PapaV,GrafoneT,etal.Multidrugresistan ce- associatedprotein1expressionisunderthecontrolofthephosphoinositide3kinase/Aktsignal transductionnetworkinhumanacutemyelogenousleukemiablasts.Leukemia.2007Mar;21( 3):427-38. 7Koji
