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1、1天钩方治疗肾性高血压大鼠的实验研究作者：杨蕾，李红宇，宓穗卿，王宁生【摘要】 目的观察天钩方对肾性高血压大鼠的降压作用，并探讨其可能的作用机制。方法应用“两肾一夹法”(2K1C)建立大鼠肾性高血压模型，观察不同剂量天钩方对模型大鼠血压、血清超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)和血清血管紧张素(Ang)、一氧化氮(NO)、一氧化氮合酶(NOS)的影响。结果天麻钩藤制剂各剂量组均能明显降低模型大鼠的血压，显著升高模型大鼠血清 SOD、GSH-Px 和 NO 水平，明显降低血清中 Ang和 MDA 含量，NOS 水平。结论天麻钩藤制剂降压作用确切，其作用机
2、制可能与其具有显著的抗氧化作用改善内皮功能有关。 【关键词】 天钩方; 肾性高血压; 抗氧化; 一氧化氮; 血管紧张素Abstract：ObjectiveTo investigate the effect of Tiangou Decoction on antihypertension in renovascular hypertension rats and its possible mechanism.MethodsTwo-kidney, one-clip (2K1C) renovascular hypertension was induced in Sprague-Dawley rats
3、, the effect of different doses of Tiangou Decoction on blood pressure, serum superoxide dismutase(SOD), malondialdehyde (MDA), glutathione peroxidase(GSH-Px), angiotensin(Ang) nitric oxide(NO), nitric oxide synthase(NOS) of experimental rat model were investigated.ResultsDifferent doses of Tiangou
4、Decoction significantly reduced the blood pressure level, increased serum superoxide dismutase(SOD) and glutathione Peroxidase(GSH-Px) activities, increased serum nitric oxide(NO) and nitric oxide synthase(NOS) contents, and decreased angiotensin(Ang),malondialdehyde (MDA) contents.ConclusionTiangou
5、 Decoction has significant effect of antihypertension. Its therapeutic mechanism may be related to the antioxidation function and improving 2endothelial function.Key words：Tiangou Decoction; Renovascular Hypertension; Antioxidation; Nitric oxide; Angiotensin高血压病的发生和演变是多因素、多层次交互作用的复杂过程，近期研究发现，氧化应激介导的
6、血管内皮功能损伤、一氧化氮等血管内皮舒张因子失活是高血压病进行性发展及靶器官损害的重要机制之一，因此保护血管内皮、抗氧化是近期评价抗高血压药物疗效的一个重要途径。天钩方是在经典平肝潜阳复方天麻钩藤饮的基础上化裁而来，由天麻、钩藤、葛根、杜仲等中药材组成，本文拟采用“两肾一夹”法建立肾性高血压动物模型，探讨该方对模型动物的降压作用及其产生的可能机制。1 材料与仪器1.1 动物 SD 大鼠 54 只，SPF 级，雄性，体质量(20020)g，由广东省实验动物中心提供，动物合格证号：粤监证字 2008D007。1.2 药物天钩方(天麻 15 g，钩藤 15 g，葛根 15 g，杜仲 10 g)购自广
7、州中医药大学大药房，经生药学鉴定为合格药材，按照常规方法煎煮，并浓缩成所需浓度的浓缩药液备用。1.3 试剂与仪器 SOD，MDA，GSH-Px，NO，NOS，iNOS 测定试剂盒，均由南京建成生物技术有限公司，批号：20090911。AngElisa 试剂盒，由 ALD 公司提供，批号 0905。无创血压测量仪(ALC-NIBP 型)，上海奥尔科特生物科技有限公司;UV-260 型紫外/可见光光度计，日本 Shimadaz(岛津)公司;多功能酶标仪，SPECTRA FLUOR PLUS，澳大利亚;LXJ-IIB 型低速大容量多管离心机，上海安亭3科学仪器厂。2 方法2.1 造模、分组与给药大鼠
8、以 10%的水合氯醛(0.4 ml/100 g)腹腔注射麻醉后的大鼠仰卧固定于手术台上，剪去腹部体毛，5%碘伏消毒，75%酒精脱碘，盖上孔巾。沿腹正中线作手术切口打开腹腔，按无菌操作，小心钝性分离出左肾动脉，穿入无菌丝线，把直径为 0.25 mm 的针灸针与肾动脉血管长轴紧贴平行放置，用无菌丝线扎紧肾动脉和针灸针后抽出针灸针，结果造成单侧肾动脉狭窄，对侧肾脏和动脉不触及。假手术组除结扎肾动脉外，其余手术操作均同上。术后 3 天内青霉素(3104U/d)腹腔注射预防感染，造模 4 周后尾套法测量大鼠血压，每次重复 3 次取其均值，以尾动脉收缩压超过 140 mmHg 的大鼠作为模型大鼠。按血压高
9、低分层后随机分为 5 组，每组 8 只，即模型对照组，阳性药物对照组，天钩方高，中，低剂量组，另设假手术组，共 6 组。按动物体表面积换算成等效剂量，天钩方高剂量组予 20 g/kg 体质量，中剂量组予 10 g/kg 体质量，低剂量组予 5 g/kg 体质量，阳性组给予依那普利 1.8 mg/kg 体质量，给药体积均为 5 ml/kg 体质量，假手术组和模型组给予等体积的生理盐水，均为灌胃给药，2 次/d，连续 8 周。2.2 血压测定采用尾动脉脉搏测压法，在大鼠安静状态下进行血压测定，连续测 3 次收缩压，取平均值作为测压结果。正式实验前，适应性测压约 2 周。待大鼠适应环境，血压稳定后，
10、开始正式实验。2.3 样本采集大鼠末次给药 30 min 后，腹主动脉取血 10 ml，4 1 200g 离心10 min，分离血清，-70冰箱保存待测。42.4 指标检测 血清 SOD 采用黄嘌呤氧化酶法测定;MDA 采用 TBA(硫代巴比妥酸)法测定;GSH-Px 采用酶促反应法测定;NO 采用硝酸还原酶法测定;NOS 采用 TBA(硫代巴比妥酸)法测定，Ang采用 Elisa 法测定，均按试剂盒说明书操作。2.5 统计学分析数据均以s 表示，应用 SPSS13.0 统计软件进行统计学处理，组间比较采用单因素方差分析 One-Way ANOVA。 3 结果3.1 天钩方对肾性高血压大鼠血压
11、的影响模型组血压与假手术组比较明显升高，各给药组均能降低模型大鼠血压，与模型组比较有显著差异(P0.01)，天钩方各剂量组存在一定的量效关系。结果见表 1。表 1 天钩方对肾性高血压大鼠血压的影响3.2 天钩方对肾性高血压大鼠血清 Ang含量的影响与假手术组相比，模型组中大鼠血清 Ang含量明显升高(P0.01)。与模型组相比，各给药组均能明显降低血清 Ang含量(P0.01)，天钩方各剂量组对血清 Ang含量的影响呈现一定的剂量依赖关系。结果见表 2。 表 2 天钩方对肾性高血压大鼠 Ang的影响3.3 天钩方对肾性高血压大鼠血清中 SOD、MDA、GSH-Px 的影响与假手术组相比，模型组
12、中大鼠血清 SOD、GSH-Px 活性明显降低，MDA 含量明显增加(P0.01)。与模型组相比，各给药组均能明显提高血清 SOD、GSH-Px 酶活力(P0.01)，降低血清 MDA 含量(P0.01)。结果见表 3。表 3 天钩方对肾性高血压大鼠血清 SOD，MDA，GSH-Px 的影响3.4 天钩方对肾性高血压大鼠血清 NO，NOS，iNOS 含量的影响与假手术组相5比，模型组中大鼠血清 NO 含量明显降低，血清 NOS 和 iNOS 的活性明显增加(P0.01)。与模型组相比，各给药组均能明显提高血清 NO 含量(P0.01)，降低血清 NOS 和 iNOS 活性含量(P0.05，P0
13、.01)。结果见表 4。4 讨论在降压药物研究中，高血压动物模型的建立有多种方法，如盐性高血压、自发性高血压(SHR)、神经内分泌型高血压、肾动脉狭窄型高血压、肾外包扎型高血压等。其中肾动脉狭窄型方法的造模原理是狭窄肾动脉造成肾脏缺血，导致肾脏内肾素形成，血管紧张素含量升高，使血压升高。模型表现与临床高血压尤其是继发性高血压的病理生理学改变相似1。此法的手术成功率较高，可达到 80%以上，术后大鼠血压稳步增高，到 4 周后形成稳定的高血压2。本实验造模 4 周后，与假手术组比较，模型大鼠收缩压均明显升高(P0.01)，血清血管紧张素含量明显高于假手术组(P0.01),表明 RHR 大鼠造模成功
14、,可用于药物研究。模型大鼠按照血压水平分层后随机分组，各组间无显著差异(P0.05)，然后进行正式实验。给药 8 周后，给药组各组大鼠的收缩压与模型组比较明显降低(P0.01)，并能够明显降低模型大鼠血清血管紧张素含量(P0.01)，在给药剂量范围内呈剂量依赖性降低关系。表明天钩方具有良好的降血压作用。表 4 天钩方对肾性高血压大鼠血清 NO，NOS，iNOS 含量的影响现代研究显示，内皮功能损伤是高血压病产生及发展过程中的重要病理表现，高血压病出现内皮功能损伤的机制是多方面的，其中氧化应激产物堆积降解 NO是其重要的机制之一。NO 是由 NOS 通过将底物 L-精氨酸的胍基氮原子末端的5 个
15、电子氧化形成 L-胍氨酸的同时产生的。NO 自由扩散到邻近的血管平滑肌细胞内，激活一系列的 G 蛋白激酶，从而引起血管舒张3。NO 对血管张力和血压6的调节具有非常重要的作用，许多研究均表明，自发性高血压大鼠(SHR)及原发性高血压(EH)患者血清 NO 水平下降，NOS 的基因表达异常，EH 患者存在 NO 生成缺陷，见有血管舒张功能障碍4。近期研究显示，高血压患者血管内皮 NO 功能失调不仅与 NO 合成减少有关，还与 NO 被超氧阴离子破坏过多有关5。高血压患者的中性粒细胞及单核细胞内的氧自由基活性增强，抗氧化酶活性减弱。SOD，GSH-Px 都是内源性抗氧化系统的重要抗氧化酶之一，可以
16、有效地消除氧自由基，从而保护 NO 不受氧自由基的破坏，保持血管正常的舒缩活性，而 MDA 的含量可有效反映体内脂质过氧化损伤和氧化应激的水平。本研究证实，与假手组比较，肾性高血压模型大鼠血清 NO 含量和血清 SOD，GSH-Px 活力明显降低(P0.01)，血清 MDA 含量明显升高(P0.01)，说明肾性高血压模型大鼠见有明显的氧化应激损伤和内皮功能失调的表现。但模型大鼠血清 NOS 和 iNOS 含量升高，可能是由于 NO 降解导致 NOS 和 iNOS 活性代偿性升高，也间接说明模型大鼠 NO 含量降低可能是由于体内超氧阴离子破坏过多导致，这还需要进一步实验证明。本研究显示，天钩方能够明显升高血清 NO 含量和血清 SOD、GSH-Px 活力(P0.01)，降低血清 MDA 含量(P0.01)，并可呈现一定的剂量依赖关系，从而说明，抗氧化、保护血管内皮功能是天钩方治疗高血压的作用机制之一。【参考文献】1 徐叔云，卞如濂，陈修. 药理实验方法学，第 3 版M.北京：人民卫生出版社，20
