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1、浙江大学硕士学位论文纳米级硅酸盐微粒吸附饲料铅的研究姓名：杨晓刚申请学位级别：硕士专业：动物营养与饲料科学指导教师：余东游;许梓荣20060501致谢本论文是在导师许梓荣教授和余东游副研究员的悉心指导下完成的。在三年研究生期间，从论文选题、试验设计、试验实施和论文写作等各方面自始至终无不凝聚着导师的心血；导师渊博的知识，敏锐的学术洞察力，让我受益非浅；导师为我的成长倾注了大量的心血，在生活上、学习上和科研工作上给予的无微不至的关怀和教诲，在此表示衷心的感谢和崇高的敬意。对李卫芬老师刘波静老师在分子生物学技术和分析测定工作上给予的大力帮助和指导表示诚挚的谢意! 感谢帅江斌博士在细胞培养技术上的无
2、私帮助!感谢贾仁清施俊轶，屠友金、夏枚生占秀安等老师在学习上的关心和訾乃涛、江霞、张红梅、傅玲琳房祥军，姚江涛、陈宁等同学的无私帮助! 感谢宁波市振宁牧业有限公司孔建维经理和童新生场长在试验过程中提供的热情照顾!值此论文完成之际，我要特别感谢在家辛勤劳作的父母，姐姐和女友对我的关心和支持，是你们的奉献和鼓励使我自信而努力地为实现人生理想而不断奋斗!最后，谨向参加本论文评阅和答辩的全体专家致以诚挚地谢意!杨晓刚2 0 0 6 年5 月于浙江大学华家池畔舒缸土学暖士学位论文搐喜摘要本课题构建的纳米硅酸赫微粒( P B N K ) 在体外对铅具有选择性吸附作用，应用C a e o - 2 细胞模型模
3、拟动物消化道，探讨了在不同的暴露条件下，P B N K 的安全性、铅对肠上皮细胞的毒性及P B N K 吸附细胞培养体系中铅毒的效果。并以“杜长大”三元杂交猪为试验动物，研究了P B N K 在胃肠道对日粮铅的吸附作用，从生长性能、养分表观消化率、组织中铅残留、肉质等方面探讨了P B N K对铅所致不良影响的缓解作用。主要结果如下：体外P B N K 对P b 2 + 、C u 2 + 、Z n 2 + 、C d 2 + 、F d + 离子的选择性吸附试验结果表明：吸附平衡后P B N K 对各种离子的吸附有较强的选择性，尤其对p b 2 + 有较强的亲和力，面对c u 2 + 、Z n 2
4、+ 、F e 2 + 和c d 2 + 亲和力较弱或几乎没有吸附。体外细胞培养结果表明：不同浓度的P B N K 在不同作用时间对细胞L D H 活性和细胞活力均无显著性影晌p 口。而铅浓度达到4 0 、8 0 m g L 时，细胞L D H 活性显著升高( p n 叮) 。同时结果还表明在常规饲料( 低铅含量) 中添加P B N K 有改善猪只增重、日采食量及料重比的趋势，但差异不明显0 n ) 。组织器官铅残留测定结果表明：对照组猪肌肉、肝脏和肾脏中铅的含量分别是0 4 5 、1 4 4 、1 7 9 9 9 g ，分别是欧盟残留限量标准的4 5 、2 8 8 、3 7 9 倍，在基础日粮
5、中添加P B N K 后，猪肌肉、肝脏和肾脏中铅的含量分别降低为欧盟残留限量标准的9 0 、7 4 、9 6 ；加铅组猪肌肉、肝脏和肾脏中铅的含量分别是欧盟残留限量标准的1 3 4 、9 1 8 、1 0 ，4 4 倍；添加P B N K 后上述含量分别降低为欧盟残留限量标准的3 0 、1 9 8 、2 1 8 倍。此外，与对照组比较，单独添加P B N K晰江上学碛士学位论文抽姜组猪的肌肉、心脏、脾脏、胰脏、肺、脑、骨骼和毛发中铅的含量均分别显著减少了8 0 ( p n 盯) 。血清相关代谢指标分析显示：与对照组相比，添加1 0 O m g k g P b 组的G O T和G P T 含量分
6、别升高了1 6 9 7 ( p a 。抗氧化能力研究表明：与对照组相比，加P B N K 组猪血清、肝脏中M D A 含量显著降低p n 4 0 8 0 m # Lp b 2 + s i g n i f i c a n t l yi n c r e a s e dr e l e a s i n gL D Hp 4 0 后，对铅离子吸附率增加不明显。在不同p l a 值条件下，P B N K 对铅离子的吸附率范围在4 5 0 7 - 9 7 2 1 。l O O，、8 0 菩6 0 霎4 0 釜2 0O1234567起始p H 值图3 - 6 起始p H 值对铅离子吸附率的影响F i g 3 6
7、E f f e c to f i n i t i a lp HO na d s o r p t i o nr a t eo f P b 2 +3 1 6P b 2 + 起始浓度对吸附的影响室温下( 2 5 ) ，p n 值为4 0 ，溶液体积为1 0 0 m L ，吸附剂P B N K 含量均为0 1 9 ，加入的P b 2 + 起始浓度分别为2 5 、5 0 、1 0 0 、2 0 0 、3 0 0 、4 0 0 m g L ，吸附膏讧土学曩士学位语文摹王章诚叠结摹时间3 0 m i n 。结果见图3 7 ，随着p b 2 + 起始浓度的增加，P B N K 对铅的平衡吸附量逐渐增加，且P
8、b 2 + 起始浓度为2 0 0m g L 时达到最大吸附量1 2 6 6 1 m g g ，此后再增加P b 2 + 起始浓度，P B N K 对铅的平衡吸附量不再增加。，、1 5 051 0 0血| l 莲5 0 督 积02 55 01 0 02 0 03 0 04 0 0p b 2 + ( m g L )图3 7p b z + 起始浓度对吸附量的影响F i g 3 7E f f e c to f i n i t i a lr , b 2 + o ne q u i l i b r i u mp b 2 + a d s o r p t i o n3 1 7P B N K 吸附铅对肠细胞结构与
9、功能的影响C a c o - 2 细胞是一种来源于人类结肠腺癌的细胞株，作为模拟人肠上皮细胞的模型被广泛用作高通量新型药物筛选和药物吸收、转运机制的研究。本试验选择以C a c o - 2 细胞单层为模型，研究在不同暴露条件下，硅酸盐纳米微粒对肠上皮细胞的安全性、铅的细胞毒性以及硅酸盐纳米微粒解铅毒的效果。3 I 7 1P B N K 对C a e o 2 细胞L D H 活性和细胞增殖率的影响乳酸脱氢酶( U ) H ) 是细胞内的大分子物质，正常情况下不能通过细胞膜，当细胞膜受到损伤时，L D H 就可以释放到细胞外。由表3 3 和图3 8 可见，与对照组相比，不同剂量的P B N K 在
10、不同0 - - 4 8 h r 内对细胞培养上清中乳酸脱氢酶( L D H ) 的活性和C a c o 2 细胞的增殖率均未产生显著影响( 芦 n ) 。表3 3P B N K 对C a c o - 2 细胞L D H 活性的影响( U L )T a b l e3 - 3E f f e c t so fP B N Ko nL D Hi nC a c o 2c e l l s ( U L )注；同行数据右肩标字母不同者差异显著( r - 00 5 ) 。下表相同。3 4卉扛土学磺士学位论文摹三幸武叠结摹 一1 22 4柏时甸( h r )0 0 2 P B N K0 I P B N KO 5 P
11、 B N K图3 - 8 不同剂量P B N K 对C a c o 2 细胞增殖率的影响F i g 3 - $ E f f e c t so f P B N Ko nc e l lp r o l i f e r a t i o nr a t e3 1 7 2 铅对C a c o 2 细胞L D H 活性和细胞增殖率的影响不同剂量铅在不同作用时间内对C a c o 2 细胞L D H 活性的影响见表3 - 4 。由表可见，C a c o 一2 细胞中加入不同剂量铅作用3 0 r a i n 后，4 0m g ，L 以上的铅浓度引起细胞培养液中L D H 活性与对照组相比有显著升高( 罗 a 弧)
12、 。表3 4 铅对C a c o - 2 细胞L D H 活性的影响( u r c )T a b l e3 - 4E f f e c t so f P b0 1 1L D Hi nC a c o - 2c e l l s ( u L )图3 - 9 显示，随着铅浓度的不断上升，铅抑制C a c o 2 细胞增殖率的程度越高。当培养液中铅的浓度为5 、1 0 、2 0m g L 时，铅对C a c o 一2 细胞增殖率的影响不明显p n ；但铅浓度达到4 0 ，8 0m g 几时，发现铅显著降低了C a c o 一2 细胞的增殖率p O 0 5 ) ；同时P B N K 组与对照组相比日增重和料
13、重比均无显著差异( 口 n 0 5 ) 。表3 - 6P B N K 吸附饲料铅对肥育猪生长性能的影响7 r a b l e3 6E f f e c to f P B N Ko nt h eg r o w t hp e r f o r m a n c eo f p i g s处理项目01 0 0 m g k gP b00 5 P B N K00 5 P B N K注：同行数据右肩标字母不同者差异显著( 矿0 5 ) 下表同3 2 2 养分表观消化率P B N K 吸附饲料铅影响肥育猪饲料养分表观消化率的结果见表3 7 。添加1 0 0 m g k g 铅组即P b 组粗蛋白、钙和磷的表观消化率
14、均显著降低。与对照组相比，P b 组的粗蛋白、钙和磷的表观消化率分别降低了9 0 1 ( p n ) 。同时，铅和P B N K 的添加对饲料中粗脂肪的表观消化率无显著影响( p n 0 5 ) 。斯缸土学硕士学位论文苇三章试骚结善表3 - 7P B N K 对肥育猪饲科养分表观消化率的影响T a b l e3 - 7E f f e c to f P B N Ko nn u t r i e n td i g e s t i b i l i t yo f f i n i s h i n gp i g s兰 尘! ! ! ! ! ! 竺! ! 型翌! ! 堡! 翌! ! ! ! ! 兰2 处理 项
15、目01 0 O m g k gP b00 5 P B N K0O 5 P B N K 干物质D M粗蚩白C P粗脂肪E E 钙C a8 7 6 6 1 趔8 6 4 5 1 7 旷7 0 ，0 3 2 J 0 36 0 4 9 4 - 2 1 0 。8 & 5 9 1 5 8 88 6 5 3 4 - 1 9 2 37 0 2 0 4 - 2 1 l6 1 0 5 2 0 l 。7 7 9 3 4 - 1 3 7 b7 8 6 6 4 - 1 6 2 56 9 0 5 4 - 2 0 35 3 4 4 1 9 5 b8 6 6 1 4 - 1 6 148 4 1 9 4 - 1 9 0 46
16、9 5 8 2 D l5 9 0 8 4 - 2 0 6 3 堡篁竖圭：丝：堡：! ! 圭! ：塑：! ! ：竺圭! 翌：! ! ：堑兰! ：! ! ：3 2 3P B N K 对猪组织与粪尿中铅残留的影响3 2 3 I 猪组织中铅残留的变化表3 8 显示，对照组猪肌肉、肝脏和肾脏中铅的含量分别是O ，4 5 、1 4 4 、1 7 9 m g k g ，分别是欧盟残留限量标准的4 5 、2 8 8 、3 7 9 倍( 欧盟规定猪肌肉、肝脏和肾脏中铅残留量分别为O 1 、O 5 、O ，5 m g k g ) ，在基础日粮中添加硅酸盐纳米添加剂后，猪肌肉、肝脏和肾脏中铅的含量得到了显著减少，分别降低为欧盟残留限量标准的9 0 、7
