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1、1克雷伯氏菌 ZD112 氯氰菊酯降解酶基因 的克隆与生物信息学分析【摘要】 目的 筛选新的菊酯农药降解酶基因并了解其特性，为解决食品和环境中的菊酯农药残留问题创造条件。方法 通过构建基因文库的方式筛选获得新的菊酯农药降解酶 (EstP) 基因，并对其进行一系列生物信息学分析。结果 获得了新的菊酯农药降解酶 (EstP) 基因。EstP 属于水解酶类，由 638 个氨基酸编码，预测分子量为 73.4 kDa，pI 值为 8.34，与其他蛋白相似性极低，不属于任何已知的蛋白超家族，仅与羧肽酶 Taq (M32) 的保守域具有一定相似性，推测 Lys137, Glu116, Glu148 为其必需
2、氨基酸。 结论 新的菊酯农药降解基因得到克隆，生物信息学分析为其定向进化提供了理论指导，为高效基因工程菌的构建打下了基础。【关键词】 菊酯农药降解酶；基因克隆；菊酯农药；生物信息学分析Molecular cloning and bioinformatic analysis of a novel pyrethroid hydrolyzing esterase from Klebsiella sp. Strain ZD112WANG Zhuo ya, LIU Yu huan, LI He1.Guangdong Pharmaceutical University, Guangzhou, Guangd
3、ong 510006;2.SUN Yat sen University, Guangzhou,Guangdong 510275,ChinaAbstract:Objective To obtain pyrethroid hydrolyzing esterase (EstP) gene and analyze the characteristics of it.Methods Bioinformatics analyzing tools were used to screen a EstP gene from Klebsiella sp. Strain ZD112 DNA library and
4、predict the character and function of the protein.Results A novel EstP with higher activity was found. EstP was a protein of 638 amino acid residues, a molecular mass of 73.4 kDa, and pI 8.34. It showed no similarities with known proteins, and did not belong to any protein superfamily. It is expecte
5、d to be related to carboxypeptidase Taq (M32) metallopeptidase, and revealed that Lys136, Glu114, Glu147 were important for the esterase activity.Conclusion A new EstP gene was obtained, which might lay a basis 2for the further study on the structure analysis and gene clone of it.Key words:pyrethroi
6、d hydrolyzing esterase; molecular cloning; pyrethroid insecticides; bioinformatic analysis拟除虫菊酯为第三代杀虫剂，其长期广泛的使用，对土壤、大气和水源等造成了不同程度的污染1 。其对健康的危害也不容忽视，主要包括对免疫系统的胁迫，对淋巴结和脾脏的损伤、致癌以及环境激素效应等2 。寻找一种有效方法消除或降低食品和环境中的菊酯农药残留已成为当前迫切需要解决的问题。在过去的研究工作中，本实验室获得了一株能以菊酯为唯一碳源和氮源生长的伯雷克氏菌株 Klebsiella sp. ZD112，鉴于直接应用农药降解酶
7、制剂比应用产酶的菌剂更有优势3，为了能够产业化生产菊酯农药降解酶，通过构建基因文库的方式获得了新的菊酯农药降解酶基因，并进行了一系列生物信息学分析，为高效基因工程菌的构建打下基础。1 材料与方法1.1 培养基LB 培养基与 LA 培养基按照分子克隆手册配制。筛选培养基为加入 100 mg/L 氨苄青霉素（ampicillin）和 100 mol/L 5 bromo 4 chloro 3 indolylcaprylate (X caprylate)的 LB 培养基（X caprylate 可被水解酶水解而形成蓝色的水解圈4）。1.2 菌株大肠杆菌 DH5 supE44, lacU169 (80
8、lacZM15), hsdR17, recA1, endA1, gyrA96, thi 1, relA1由本实验室保存，菊酯农药降解酶生产菌株 Klebsiella sp. ZD112 菌株由本实验室从污染土壤分离。pUC18 质粒购自 TaKaRa 公司。31.3 酶和试剂各种限制性内切酶、DNA marker、X Gal、IPTG 购自 TaKaRa 公司,T4 连接酶、去磷酸化酶购自 MBI 公司。其他生物化学试剂均为国产分析纯。1.4 基因文库的构建参照分子克隆手册提取 Klebsiella sp.ZD112 基因组 DNA 和 pUC18 质粒。ZD112 基因组 DNA 经 Hin
9、d不完全酶切后电泳，按照 3 S DNA Gel Purification kit 试剂盒说明书割胶回收 210 kb 片断。pUC18 经 Hind酶切后去磷酸化后并电泳，割胶回收。将酶切并回收的 DNA 片断与去磷酸化的克隆载体按 51 的比例 16 连接过夜，Ca 转入大肠杆菌 DH5，并涂布 LA 平板，进行蓝白斑筛选。1.5 目标亚克隆的筛选挑取白色的转化子到含酯酶底物(X caprylate)的筛选平板上培养过夜，挑取有蓝色水解圈形成的转化子保存并接种于 LA 液体培养基中振荡培养。提取质粒酶切验证，同时破碎菌体提取粗酶液,测定其对氯氰菊酯的降解率。 1.6 亚克隆测序与分析测序由
10、上海博亚生物公司完成。对插入片断通过 ORF Finder ( http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf.html )寻找读码框，并采用 BLASTn ( http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ )进行同源性分析。1.7 目的基因生物信息学分析4分子量和等电点计算采用 DNAstar5.0 软件计算；蛋白保守域查询采用rpsBlast ( http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/ wrpsb.cgi )，数据库选择为 CDD v2.06-11530 PSMMs，鉴于 EstP 与其他蛋白的同源性非常低，
11、E 值选择时适当放宽，设为 1；酶与非酶分析采用基于蛋白氨基酸序列性质的 ArchaeaFun 1.0 Server (http:/genome.cbs.dtu.dk/ services/Archaea Fun)；蛋白超家族分析采用基于隐马尔科夫 (Hidden Markov Model, HMM) 算法的 Superfamily 1.61 (http:/supfam.mrc lmb.cam.ac.uk/SUPERFAMILY/) ，参数选择：example sequence: Amino acid sequence，Scoring options: Local/local model/seq
12、uence scoring，Blast Pre filter P value10e 10；蛋白亚细胞定位采用 Loctree 服务器(http:/cubic.bioc.columbia.edu/services/loctree/ )；EstP 的多序列比对使用 Clustal X 软件，相似序列由 rpsBlast 获得，蛋白势能矩阵选择为 Blosum series。2 结果与分析2.1 基因文库的构建通过蓝白斑筛选，共获得白色克隆约 3 万个。ZD112 基因组 DNA 不完全酶切结果见图 1，质粒 pUC18 的 Hind 酶切图见图 2。2.2 目标亚克隆的筛选与鉴定挑取 1 500
13、个阳性克隆至到含底物（X caprylate）筛选培养基。获得 4 个能在筛选培养基产生蓝色水解圈的单菌落，挑取后加入 Amp 含量为 100 mg/L 的 LB液体培养基培养,甘油保存。其粗酶液对氯氰菊酯的降解率见表 1，ZD112 粗酶液作对照5。5挑选降解率高的阳性克隆子 LA5 进行酶切（图 3），从图中可知，L5A 连接上了大约 3.6 kb 左右的片段,送测序公司测序(图 4) 。用 NCBI 上的工具 ORF finder 分析 LA5 的克隆片段,发现其含有 2 个较大的开放读码框(ORF),一个长度为 1 914 bp(ORF1，登录号: AY995176),另外一个长度为7
14、56 bp(ORF2，登录号: AY954696)。其中 ORF1 仅与 2 个细菌预测蛋白有一定相似性（hypothetical protein SC171：88%相似；ebA4602：36 %相似），并含有-10,-35 以及 RBS(ribosomal binding site)序列（图 5），因此该 ORF 可能是编码菊酯降解酶 (EstP) 的新基因。表 1 各阳性克隆与 ZD112 的降解率（略）2.3 生物信息学分析结果EstP 由 637 个氨基酸组成，经 DNAstar5.0 计算出其分子量为 73.4 kDa，pI 值为 8.34。蛋白亚细胞定位分析结果显示，EstP 属于
15、细胞质内蛋白。酶与非酶的分析结果表明，EstP 是酶，并且属于水解酶类（图 6）。进一步分析发现，EstP 不属于任何已知的蛋白超家族，与 EstP 具同源性的已知蛋白也非常少。rpsBlast 分析（图 7）表明，EstP 仅有一段很短的序列（71149 氨基酸区段）与羧肽酶 Taq (M32) 的保守域有最高的相似性，这段序列还与预测膜蛋白 COGO0012 有一定的相似性。通过对已知结构蛋白 Taq (M32) 的三级结构（图 8）的分析发现，其与 EstP 具有同源性的序列呈 V 字型，且 Taq (M32) 的活性位点正位于这一区段内，由此，推测 EstP 的活性中心可能位于其 71
16、149 氨基酸区段内。3 讨 论6作为目前最有发展前途的杀虫剂，拟除虫菊酯尚未找到新型的替代化合物，在未来十几年内仍将广泛使用。采用微生物农药降解酶解决菊酯农药残留污染问题是当前环境科学研究的热点,也是一个较新的研究领域。由于农药降解酶在野生菌株中含量太低，生产成本高昂且难以大量生产，如何产业化地生产农药降解酶成为农药降解酶应用必须解决一个关键性问题。农药降解酶基因的克隆、表达以及定向进化可以构建出降解谱广、降解能力强的工程菌，为微生物降解农药开辟了新途径。在之前的研究中，本实验室从农药厂的污泥中筛选出能降解菊酯农药的伯雷克氏菌株 Klebsiella sp. Strain ZD112 。通过构建基因文库的方式，获得了一个具有菊酯降解活性的克隆子，对测序结果进行 ORF 分析，该 ORF1 在 NCBI 上比对的结果都是一些细菌的预测蛋白，如：它与 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Choleraesuis 的预测蛋白 hypothetical
