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1、RTRTRTRT系统系统系统系统TIANGEN BIOTECH (BEIJING) CO.,LTDTIANGEN BIOTECH (BEIJING) CO.,LTD“从从从从RNA提取到荧光定量提取到荧光定量提取到荧光定量提取到荧光定量PCR”解决方案解决方案解决方案解决方案市场部市场部市场部市场部李露露李露露李露露李露露?RT-PCR原理简介原理简介原理简介原理简介?RT-PCR技术中的关键点技术中的关键点技术中的关键点技术中的关键点?TIANGEN公司公司公司公司RT产品选择指南产品选择指南产品选择指南产品选择指南RT-PCR原理简介原理简介原理简介原理简介RNAcDNA目的目的目的目的片
2、段片段片段片段PCRRTcDNA第一链合成法示意图第一链合成法示意图第一链合成法示意图第一链合成法示意图（两步法两步法两步法两步法）一步法实验示意图一步法实验示意图一步法实验示意图一步法实验示意图（同一个反应管中同一个反应管中同一个反应管中同一个反应管中）适用于适用于适用于适用于适用于适用于适用于适用于mRNAmRNAmRNAmRNAmRNAmRNAmRNAmRNA表达量解析表达量解析表达量解析表达量解析表达量解析表达量解析表达量解析表达量解析 Two Step RTTwo Step RTTwo Step RTTwo Step RTTwo Step RTTwo Step RTTwo Step
3、RTTwo Step RT- - - - - - - -PCRPCRPCRPCRPCRPCRPCRPCR效率高效率高效率高效率高效率高效率高效率高效率高 使用使用使用使用使用使用使用使用RandomRandomRandomRandomRandomRandomRandomRandom和和和和和和和和OligoOligoOligoOligoOligoOligoOligoOligo- - - - - - - -dTdTdTdTdTdTdTdT引物可以制备引物可以制备引物可以制备引物可以制备引物可以制备引物可以制备引物可以制备引物可以制备cDNAcDNAcDNAcDNAcDNAcDNAcDNAcDNA
4、 poolpoolpoolpoolpoolpoolpoolpool cDNAcDNAcDNAcDNAcDNAcDNAcDNAcDNA可长期保存可长期保存可长期保存可长期保存可长期保存可长期保存可长期保存可长期保存Two Step RTTwo Step RTTwo Step RTTwo Step RTTwo Step RTTwo Step RTTwo Step RTTwo Step RT- - - - - - - -PCRPCRPCRPCRPCRPCRPCRPCRcDNAcDNAcDNAcDNAcDNAcDNAcDNAcDNA分装分装分装分装分装分装分装分装One Step RTOne Step
5、 RTOne Step RTOne Step RTOne Step RTOne Step RTOne Step RTOne Step RT- - - - - - - -PCRPCRPCRPCRPCRPCRPCRPCR适用于病毒适用于病毒适用于病毒适用于病毒、病原菌检测病原菌检测病原菌检测病原菌检测适用于病毒适用于病毒适用于病毒适用于病毒、病原菌检测病原菌检测病原菌检测病原菌检测 操作简单操作简单操作简单操作简单操作简单操作简单操作简单操作简单 污染几率低污染几率低污染几率低污染几率低污染几率低污染几率低污染几率低污染几率低RT-PCR两种方法两种方法两种方法两种方法目的片段在目的片段在目的片段
6、在目的片段在目的片段在目的片段在目的片段在目的片段在mRNAmRNAmRNAmRNAmRNAmRNAmRNAmRNA任何位置都任何位置都任何位置都任何位置都任何位置都任何位置都任何位置都任何位置都能使用能使用能使用能使用。通常通常通常通常能使用能使用能使用能使用。通常通常通常通常mRNAmRNAmRNAmRNAmRNAmRNAmRNAmRNA表达量分表达量分表达量分表达量分表达量分表达量分表达量分表达量分析最适析最适析最适析最适析最适析最适析最适析最适。目的片段在距目的片段在距目的片段在距目的片段在距目的片段在距目的片段在距目的片段在距目的片段在距Poly(A) Tail Poly(A) Ta
7、il Poly(A) Tail Poly(A) Tail Poly(A) Tail Poly(A) Tail Poly(A) Tail Poly(A) Tail 2kbp2kbp2kbp2kbp2kbp2kbp2kbp2kbp以内适用以内适用以内适用以内适用以内适用以内适用以内适用以内适用。One Step RTOne Step RTOne Step RTOne Step RTOne Step RTOne Step RTOne Step RTOne Step RT- - - - - - - -PCRPCRPCRPCRPCRPCRPCRPCR只能使用只能使用只能使用只能使用只能使用只能使用只能使
8、用只能使用Gene specific PrimerGene specific PrimerGene specific PrimerGene specific PrimerGene specific PrimerGene specific PrimerGene specific PrimerGene specific Primer，不适用于不适用于不适用于不适用于不适用于不适用于不适用于不适用于mRNAmRNAmRNAmRNAmRNAmRNAmRNAmRNA表达量分析等表达量分析等表达量分析等表达量分析等表达量分析等表达量分析等表达量分析等表达量分析等复数基因的检出复数基因的检出复数基因的检出复
9、数基因的检出。复数基因的检出复数基因的检出复数基因的检出复数基因的检出。Random 6merRandom 6merRandom 6merRandom 6merRandom 6merRandom 6merRandom 6merRandom 6mer1,500base1,500base1,500base1,500base1,500base1,500base1,500base1,500base目的片段目的片段目的片段目的片段目的片段目的片段目的片段目的片段5 5 5 5 5 5 5 5 3 3 3 3 3 3 3 3 R R R R R R R RF F F F F F F F5 5 5 5 5
10、5 5 5 3 3 3 3 3 3 3 3 Gene specific PrimerGene specific PrimerGene specific PrimerGene specific PrimerGene specific PrimerGene specific PrimerGene specific PrimerGene specific Primer目的片段目的片段目的片段目的片段目的片段目的片段目的片段目的片段R R R R R R R RF F F F F F F FAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA A A A A A A A A5 5 5 5 5 5 5 5
11、3 3 3 3 3 3 3 3 目的片段目的片段目的片段目的片段目的片段目的片段目的片段目的片段R R R R R R R RF F F F F F F F2,000base2,000base2,000base2,000base2,000base2,000base2,000base2,000baseOligoOligoOligoOligoOligoOligoOligoOligo dTdTdTdTdTdTdTdT PrimerPrimerPrimerPrimerPrimerPrimerPrimerPrimerRTRTRTRT引物的选择引物的选择引物的选择引物的选择?RT-PCR原理简介原理简介原
12、理简介原理简介?RT-PCR技术中的关键点技术中的关键点技术中的关键点技术中的关键点?TIANGEN公司公司公司公司RT产品选择指南产品选择指南产品选择指南产品选择指南?模板模板模板模板：总总总总RNA，mRNA，体外转录的体外转录的体外转录的体外转录的RNA?引物引物引物引物：随机引物随机引物随机引物随机引物，Oligo dT，基因特异性引物基因特异性引物基因特异性引物基因特异性引物(GSP)?反转录酶反转录酶反转录酶反转录酶：AMVM-MLVQuant Reverse TranscriptaseRT反应体系反应体系反应体系反应体系逆转录酶的选择逆转录酶的选择逆转录酶的选择逆转录酶的选择?
13、AMV：禽成髓细胞瘤病毒，逆转录酶和RNA酶H活性,最适42。? M-MLV：Moloney 鼠白血病病毒，逆转录酶，RNA酶H活性较弱。最适37或42。? Quant Reverse Transcriptase全新高效逆转录酶，与RNA模板的亲和力强， 对GC含量高的模板通读效果好，质量稳定，最适37。RNase H的作用 水解水解水解水解RNA-DNA杂合链中的杂合链中的杂合链中的杂合链中的RNA? 分离高质量分离高质量分离高质量分离高质量RNA ? 使用高活性的逆转录酶使用高活性的逆转录酶使用高活性的逆转录酶使用高活性的逆转录酶? 提高逆转录酶保温温度提高逆转录酶保温温度提高逆转录酶保温
14、温度提高逆转录酶保温温度? 减少基因组减少基因组减少基因组减少基因组DNA污染污染污染污染RT实验要素实验要素实验要素实验要素决定反应的特异性及灵敏性决定反应的特异性及灵敏性决定反应的特异性及灵敏性决定反应的特异性及灵敏性1.1.1.1.RNARNARNARNA降解或起始量少降解或起始量少降解或起始量少降解或起始量少2.2.2.2.RNARNARNARNA提取后含抑制成提取后含抑制成提取后含抑制成提取后含抑制成分分分分3.3.3.3.cDNAcDNAcDNAcDNA合成时引物退火合成时引物退火合成时引物退火合成时引物退火不充分不充分不充分不充分4.4.4.4.PCRPCRPCRPCR失败失败失
15、败失败5.5.5.5.目的基因在组织中不目的基因在组织中不目的基因在组织中不目的基因在组织中不表达或表达量低表达或表达量低表达或表达量低表达或表达量低原因原因原因原因对对对对策策策策1.1.1.1.分离无污染分离无污染分离无污染分离无污染、高质量的高质量的高质量的高质量的RNARNARNARNA，用用用用0.10.10.10.10.50.50.50.5g乙酰乙酰乙酰乙酰BSABSABSABSA增加增加增加增加RNARNARNARNA的量的量的量的量2.2.2.2.用用用用70%70%70%70%乙醇洗涤乙醇洗涤乙醇洗涤乙醇洗涤RNARNARNARNA3.3.3.3.确定退火温度适合实验中确定退
16、火温度适合实验中确定退火温度适合实验中确定退火温度适合实验中所用的引物所用的引物所用的引物所用的引物4.4.4.4.PCRPCRPCRPCR步骤中步骤中步骤中步骤中cDNAcDNAcDNAcDNA模板不能模板不能模板不能模板不能超过反应体积的超过反应体积的超过反应体积的超过反应体积的1/51/51/51/55.5.5.5.尝试其它组织尝试其它组织尝试其它组织尝试其它组织问题1：RT-PCR没有产物问题2：非特异性扩增1.1.1.1.RNARNARNARNA中有内源或外源中有内源或外源中有内源或外源中有内源或外源DNADNADNADNA污染污染污染污染2.2.2.2.引物和模板非特异性引物和模板
17、非特异性引物和模板非特异性引物和模板非特异性退火退火退火退火3.3.3.3.基因特异性引物设计基因特异性引物设计基因特异性引物设计基因特异性引物设计较差较差较差较差4.4.4.4.形成引物二聚体形成引物二聚体形成引物二聚体形成引物二聚体5.5.5.5.镁离子浓度太高镁离子浓度太高镁离子浓度太高镁离子浓度太高原因原因原因原因对对对对策策策策1.1.1.1.用扩增级用扩增级用扩增级用扩增级DNase1DNase1DNase1DNase1处理处理处理处理RNA,RNA,RNA,RNA,使用抗气雾剂的吸头使用抗气雾剂的吸头使用抗气雾剂的吸头使用抗气雾剂的吸头2.2.2.2.cDNAcDNAcDNAcD
18、NA合成中使用基因特异合成中使用基因特异合成中使用基因特异合成中使用基因特异性引物性引物性引物性引物，使用递减使用递减使用递减使用递减PCRPCRPCRPCR3.3.3.3.遵循用于扩增引物设计的遵循用于扩增引物设计的遵循用于扩增引物设计的遵循用于扩增引物设计的同样原则同样原则同样原则同样原则4.4.4.4.设计在设计在设计在设计在3 3 3 3端没有互补序列端没有互补序列端没有互补序列端没有互补序列的引物的引物的引物的引物5.5.5.5.优化镁离子浓度优化镁离子浓度优化镁离子浓度优化镁离子浓度非特异性扩增问题3：弥散1.1.1.1.cDNAcDNAcDNAcDNA第一链产物的含第一链产物的含
19、第一链产物的含第一链产物的含量过高量过高量过高量过高2.2.2.2.DNaseDNaseDNaseDNase降解降解降解降解DNADNADNADNA产生的产生的产生的产生的寡核苷酸的非特异性寡核苷酸的非特异性寡核苷酸的非特异性寡核苷酸的非特异性扩增扩增扩增扩增3.3.3.3.PCRPCRPCRPCR反应中引物过多反应中引物过多反应中引物过多反应中引物过多4.4.4.4.循环数过多循环数过多循环数过多循环数过多5.5.5.5.退火温度过低退火温度过低退火温度过低退火温度过低原因原因原因原因对对对对策策策策1.1.1.1.常规常规常规常规PCRPCRPCRPCR步骤中减少模板步骤中减少模板步骤中减
20、少模板步骤中减少模板cDNA的量的量的量的量2.2.2.2.提取高质量提取高质量提取高质量提取高质量RNARNARNARNA，防止被防止被防止被防止被DNADNADNADNA污染污染污染污染3.3.3.3.减少引物的用量减少引物的用量减少引物的用量减少引物的用量4.4.4.4.优化优化优化优化PCRPCRPCRPCR反应条件反应条件反应条件反应条件，减少减少减少减少PCRPCRPCRPCR的循环次数的循环次数的循环次数的循环次数5.5.5.5.提高退火温度提高退火温度提高退火温度提高退火温度，防止非特防止非特防止非特防止非特异性的起始及延伸异性的起始及延伸异性的起始及延伸异性的起始及延伸弥 散
21、?RT-PCR原理简介原理简介原理简介原理简介?RT-PCR技术中的关键点技术中的关键点技术中的关键点技术中的关键点?TIANGEN公司公司公司公司RT产品选择指南产品选择指南产品选择指南产品选择指南400/138025/100次次次次TIANScript cDNA第一链合成试剂盒第一链合成试剂盒第一链合成试剂盒第一链合成试剂盒KR104250/8505000/20000UTIANScript M-MLVER104-03/04140050次次次次Quant一步法一步法一步法一步法RT-PCR试剂盒试剂盒试剂盒试剂盒 NewKR1131000/300025/100次次次次Quant cDNA第一链合成试剂盒第一链合成试剂盒第一链合成试剂盒第一链合成试剂盒KR103-03/04850/1500/280025/50/100次次次次Quant Reverse TranscriptaseER103-02/03/04价格价格价格价格（元元元元）包装包装包装包装产品名称产品名称产品名称产品名称目录号目录号目录号目录号TIANGEN公司公司公司公司RT产品系列产品系列产品系列产品系列
