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1、1Minitab 软件在多杀菌素发酵条件优化 中的应用【摘要】 利用 Minitab 软件，采用响应面方法(response surface methods，RSM)对多杀菌素发酵条件进行优化。通过 PlackeetBurman 设计实验，从培养基中筛选出显著性影响因子：葡萄糖、棉籽粉、玉米浆的浓度以及初始 pH，并确定非显著影响因素的水平；采用中心组合设计，对四个显著影响因素进一步的优化，根据建立的多元二次方程确定其最佳水平，得到最佳的培养条件(g/L)：葡萄糖 68.5，麦芽糖10，棉籽粉 26.0，玉米浆 17.8，牛肉膏 2.0，硫酸锌 0.2，硫酸铵 1.5，CaCO3 5；接种量
2、10%，初始 pH7.0，摇床转速 220r/min，培养 7d。在此条件下，多杀菌素的产量为 175mg/L，比优化前(120mg/L)产量提高了 45.8%。 【关键词】 多杀菌素； Minitab 软件； 响应面方法(RSM)； 优化ABSTRACT Using response surface methods with the aid of Minitab software, the fermentation materials were investigated and optimized. The significant impact factor of the different
3、 fermentation conditions were screened and identified by PlackeetBurman experimental design. The level of significant factors were further optimized using central composite design. From the resulting of multiquadratic equation, the optimized levels of influencing factors could be established. The op
4、timized medium was as follows: glucose 68.5 g/L; maltose 10 g/L; cottonseed meal 26.0 g/L; corn steep liquor 17.8 g/L; beef extract 2.0 g/L; zinc sulfate 0.2 g/L; ammonium sulfate 1.5 g/L; CaCO3 5 g/L and the pH adjusted to 7.0. The optimized culture condition: shaker speed 220 r/min; inoculum size
5、10% v/v; and cultivated for 7 days. The production titer of this condition in shakeflask reached 175 mg/L, which was increased by 45.8% compared with the previous condition.KEY WORDS Spinosad; Minitab software; Response surface methods; Fermentation optimization多杀菌素(spinosyn A 和 D 的混合物)是一种新型生物农药，可以有
6、效的防治鳞翅目害虫13，不仅杀虫活性高，与化学农药相当，而且半衰期短，降解完全，对2动物和昆虫天敌安全4，科学家们对其生物学特性和生物防治的应用条件进行了大量的研究5，6。目前多杀菌素的生产都是放线菌刺糖多孢菌经有氧发酵得到的，而改善发酵培养条件，使生产菌的性状得以充分高效的表达，是提高次级代谢物产量的有效途径。为了找到一个快速有效而且简单的统计软件对发酵培养基和工艺条件进行优化，本文尝试使用 Minitab 软件。该软件不仅可以进行PlackeetBurman 和中心组合(Centralcompositedesign)等实验设计， 而且包含对应实验的方差分析，回归分析和模型方程的拟合，不用编
7、程和计算就能快速而有效的找出主要影响因素以及各因素间的交互作用，软件自动生成的二维和三维图可以帮助我们直观的分析各因素间的关系，最终得到合理的最佳组合。建立的回归方程还能对实验结果进行预测，进一步检查实验设计和结果的准确性。整个优化过程，从实验设计到结果分析，从方程拟合到图形建立，在 Minitab 软件中都能很好的实现。近年来，Minitab 软件在国外已经被广泛的应用在质量控制、管理和科研等领域，国内仅有关于其使用方法的报道7，关于应用的报道还很少。本文利用 Minitab 软件对生物农药多杀菌素的发酵培养条件进行优化。1 材料和方法1.1 菌种刺糖多孢菌(Saccharopolyspor
8、a spinosa)U4213，本实验室保藏。1.2 培养基斜面培养基(g/L) 葡萄糖 10，NZAmine A 30，酵母膏 1.0，牛肉膏 1.0，琼脂15；pH7.07.5(用 NaOH 调节)。种子培养基(g/L) 葡萄糖 10，NZAmine A 30，酵母膏 3.0；pH7.07.5(用3NaOH 调节)。初始发酵培养基(g/L) 葡萄糖 60，麦芽糖 10，棉籽粉 20，玉米浆 15，硫酸锌 0.2，硫酸铵 1.5，CaCO3 5；pH7.07.5(用 NaOH 调节)。1.3 培养方法(1)菌种活化和种子培养 将 4保藏的斜面菌种转接到新鲜的斜面上，30生化培养箱中培养 71
9、0d；取一环斜面活化菌种接入 30ml 种子培养基，在 30温度下 220r/min 摇床中振荡培养 60h。(2)发酵培养 取种子培养液以 10%的接种量接入 30ml 发酵培养基，在 30温度下 220r/min 摇床中振荡培养 7d，每个样品做 3 个平行样，结果取平均值。摇瓶培养实验的装液量均为 30ml 的培养基于 250ml 的锥形瓶中。1.4 产物检测方法取 5.0ml 同批发酵液，加入 5.0ml 甲醇，充分振荡，超声波处理 15min，室温浸提12h；5000r/min 离心 10min；取上清液经 0.45m 微孔滤膜过滤后进行高效液相色谱分析(HPLC)。色谱柱为 Lab
10、Alliance C18 反相柱(250mm4.6mm，5m)；检测器为 UV 检测器(Model 500，美国)，波长 246nm；流动相为甲醇乙腈乙酸铵水溶液(1%，w/v)=40555(v/v)；流速：1.0ml/min；柱温：30；进样量：20l。1.5 响应面方法设计实验利用 Minitab 软件设计实验和对实验结果进行分析。设计 PlackeetBurman(PB)4实验，从发酵培养基和工艺条件的一些因素中筛选出对多杀菌素产量有重要影响的因素；通过中心组合实验设计，对 PB 筛选实验中确定的显著性影响因素进一步的优化，得到多杀菌素产量达到最大时的最佳培养条件。(1)Plackeet
11、Burman(PB)实验设计和结果分析方法 根据单因素的实验结果和文献报道，选取发酵培养基组分和工艺条件中的 8 个因素作为考察对象，每个因素取高、低两个水平，分别记做 1 和-1，在 Minitab 软件中，按照MinitabStatDOEFactorialCreate Factorial DesignPlackeetBurman 的顺序设计 12 次的 PlackeetBurman 实验；按照实验设计进行实验。在 Minitab 软件中，按照 MinitabStatDOEFactorialAnalyze Factorial Design 的顺序对实验结果进行分析。(2)中心组合实验设计和结
12、果分析方法 在 Minitab 软件中，按照MinitabStatDOEResponse SurfaceCreate Response Surface DesignCentral composite 的顺序，对 PB 实验筛选得到的显著性因素进一步优化，进行 4 因素 5水平的 31 组中心组合设计实验，设计实验的中心点编码为 0，0，0，0，实验的实际浓度选取 PB 实验中高低水平浓度的中点值，即葡萄糖 70g/L，棉籽粉 25g/L，玉米浆 15g/L，初始 pH7.2，其余的非显著因素浓度取初始培养基的配方值。2 结果与讨论2.1 PlackeetBurman 筛选实验按照 1.5(1)
13、的实验设计方法考察葡萄糖(X1)，麦芽糖(X2)，棉籽粉(X3)，玉米浆(X4)，硫酸锌(X5)，硫酸铵(X6)，接种量(X7)和初始 pH(X8)8 个因素对响应值 Y(多5杀菌素产量)的影响，各因素的水平和实验结果见 Tab.1 和 Tab.2。按 1.5(1)的方法对实验数据进行分析，得到各因素对响应值的影响效应如 Tab.3所示。从 Tab.3 可以看出，在多杀菌素的发酵生产中，X1、X3、X4 和 X8 是主要的影响因素，在 95%的概率水平上影响显著。X2 和 X5 的影响为负效应，应当取其低水平，X6 和 X7 的影响为正效应，取其高水平，因此根据 PB 实验结果可以初步确定非显
14、著影响因素的水平：即麦芽糖 10g/L，硫酸锌 0.2g/L，硫酸铵 1.5g/L，接种量10%。2.2 中心组合实验设计及结果按照 1.5(2)确定的各因素编码水平和实验设计方法设计中心组合实验，各因素编码水平及实验结果分别见 Tab.4 和 Tab.5。 2.3 响应面分析利用 Minitab 软件，按照 MinitabStatDOEResponse SurfaceAnalyze Response Surface Design 的顺序，对中心组合设计实验结果进行响应面分析，分析结果见 Tab.6 所示。从表 Tab.6 中可以看出，X1、X2、X3 和 X4 即葡萄糖、棉籽粉、玉米浆和初始
15、 pH 四个因素对多杀菌素产量都有显著的影响，而且线性和曲面效应都很显著。2.4 响应面方程的建立根据实验分析结果得到的各因素效应系数，建立多杀菌素产量对四个显著影响因素的多元二次方程，如式(1)所示。对方程进行方差分析结果见 Tab.7 所示。6Y=-21046+106.803333+83.780771+159.691778+4294.930804-0.767869+0.380000-2.134358+0.070000+0.115625-1.170108-1.825000-0.104167-17.953125-274.605655(1)该回归方程的相关系数为 R2=0.970，只有 3%的数
16、值失拟，说明该模型方程能够较好的用于多杀菌素的发酵培养基组分及其产量的预测。从回归方程的方差分析可以看出，模型的回归效果高度显著，说明该模型能够很好的拟合实验数据，另外，回归方程的一次项、二次项的影响显著，说明 RSM 法所选的因素对多杀菌素产量影响的效应显著。在 Minitab 软件中，按照 MinitabStatDOEResponse SurfaceContour Surface(Wireframe)Plots 的顺序，设置不同的因素，就可得到软件自动生成的响应值与任意两个因素关系的响应面图和对应的等高线图，Fig.1 给出了多杀菌素产量与葡萄糖浓度以及玉米浆浓度的响应面图和等高线图。由 Minitab 软件中 2 因素响应面图可以看出，在实验范围内，多杀菌素产量存在最大值。对所得的回归方程分别求四个变量的一阶偏导数,并令其为 0，得到四元一次方程组,求解即可得到多杀
