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1、学 校 代 码 ： 10270 分 类 号 ： Q51 学 号 ： 092200994硕 士 学 位 论 文论文题目 鳝 鱼 蛋 白 质 成 分 分 离 与 生 物 活 性研究学 院 生命与环境科学学院专 业 高分子化学与物理研究方向 蛋白质分离纯化研究生姓名 王博文指导教师 任天瑞完成日期 2012 年 4 月论 文 题 目 ： 鳝 鱼 蛋 白 质 成 分 分 离 与 生 物 活 性 研 究学 科 专 业 ： 高 分 子 化 学 与 物 理学 位 申 请 人 ： 王 博 文指 导 教 师 ： 任 天 瑞中文摘要对 生 物 大 分 子 的 提 取 、 分 离 及 纯 化 是 我 们 开 发 其
2、 功 能 、 探 讨 其 在 生 物 体 中 的生 命 现 象 ， 进 而 发 挥 其 生 物 学 活 性 的 重 要 前 提 。 本 论 文 首 先 从 黄 鳝 新 鲜 血 液 中 得到 血 清 ， 分 别 用 （ NH4） 2SO4、 Na2SO4 和 辛 酸 -（ NH4） 2SO4 溶 液 盐 析 法 提取 粗 蛋 白 ， 采 用 阴 离 子 交 换 柱 层 析 （ 填 料 为 DE52） 纯 化 球 蛋 白 。 采 用 SDS-PAGE凝 胶 电 泳 法 ， 对 样 品 中 蛋 白 的 纯 度 和 分 子 量 进 行 了 测 定 。 运 用 生 物 质 谱 法 对 样 品蛋 白 进
3、行 分 析 鉴 定 ， 通 过 搜 库 比 对 确 定 其 种 类 、 基 因 序 列 和 精 确 的 分 子 量 。 然 后我 们 对 该 蛋 白 进 行 了 物 理 化 学 性 质 的 表 征 。 采 用 原 子 力 显 微 镜 表 征 蛋 白 质 表 面 形貌 ， 所 用 探 针 微 悬 臂 为 氧 化 蚀 刻 硅 微 悬 臂 。 运 用 圆 二 色 谱 仪 对 黄 鳝 血 清 转 铁 蛋 白的 二 级 结 构 进 行 了 表 征 ， 样 品 蛋 白 液 的 测 量 范 围 为 远 紫 外 区 ， 即 190-260nm。最 后 我 们 对 该 蛋 白 的 生 物 学 活 性 做 了 简
4、 单 的 初 步 探 索 ， 选 择 操 作 简 单 、 重 复 性 好的 MTT 法抗癌药物敏感试验检测蛋白对白血病细胞株的作用。黄鳝（M onopterus albus） ， 属 合 鳃 鱼 目 ， 合 鳃 鱼 科 ， 黄 鳝 属 。 广 泛 分 布在 热 带 及 亚 热 带 地 区 ， 在 我 国 东 南 部 地 区 ， 在 泰 国 、 印 度 尼 西 亚 等 东 南 亚 地 区 均有 大 量 分 布 。 由 于 它 富 含 营 养 、 肉 质 鲜 美 、 有 多 种 对 人 体 有 益 的 氨 基 酸 ， 特 别 是中 医 还 将 黄 鳝 作 为 重 要 的 药 材 ， 因 此 它 深
5、 受 世 界 上 广 大 消 费 者 的 喜 爱 。 前 人 已 经有 很 多 关 于 黄 鳝 形 态 学 、 繁 殖 行 为 和 经 济 价 值 的 研 究 。 但 是 还 没 有 关 于 黄 鳝 血 清转 铁 蛋 白 的 表 征 及 生 物 活 性 方 面 的 研 究 。 黄 鳝 血 的 利 用 率 极 低 ， 因 此 我 们 选 择 黄鳝 的 血 为 实 验 材 料 。本 实 验 采 用 离 子 交 换 柱 层 析 法 对 提 取 出 的 蛋 白 进 行 纯 化 。 我 们 使 用 的 是DE52 阴 离 子 交 换 柱 层 析 填 料 ， 蛋 白 样 品 的 上 样 量 为 10 mg
6、(约 4 ml)， 柱 层 析 的洗 脱 速 度 0.3 ml/min。本 实 验 采 用 SDS-PAGE 凝 胶 电 泳 法 ， 对 样 品 中 蛋 白 的 纯 度 和 分 子 量 进 行 了测 定 ， 浓 缩 胶 浓 度 4%， 分 离 胶 浓 度 12.5%。 结 果 显 示 电 泳 得 到 两 条 清 晰 的 条 带 ，根 据 文 献 ， 我 们 选 择 分 子 量 较 大 的 蛋 白 进 行 接 下 来 的 种 类 鉴 定 、 物 理 化 学 性 质 表征 和 生 物 活 性 实 验 。本 实 验 中 利 用 生 物 质 谱 法 对 得 到 蛋 白 的 种 类 进 行 鉴 定 。
7、生 物 质 谱 法 的 实 验 步骤 可 概 括 为 ： 黄 鳝 蛋 白 液 浓 缩 后 ， 经 酶 切 ， 毛 细 管 色 谱 分 离 ， 进 入 质 谱 进 行 鉴 定 。产 生 的 串 联 质 谱 图 生 成 质 量 数 据 文 件 在 设 置 SEQUEST 结 果 过 滤 参 数 后 于Smegmamorpha 蛋 白 库 中 进 行 检 索 比 对 。实 验 中 采 用 原 子 力 显 微 镜 表 征 蛋 白 质 表 面 形 貌 ， AFM 的 优 点 在 于 ： 观 察的 样 品 范 围 很 广 ， AFM 可 在 真 空 、 空 气 、 液 相 中 观 察 样 品 ； 由 于
8、可 在 液 态 环 境中 观 察 ， 故 AFM 可 在 生 理 条 件 下 对 活 细 胞 进 行 观 察 ， 并 可 实 时 观 察 某 些 动 态 的生 化 反 应 ； 成 像 时 间 短 ， 可 捕 捉 一 些 快 速 反 应 过 程 。 本 实 验 所 用 探 针 微 悬 臂 为 氧化蚀刻硅微悬臂，采用 Tapping（轻敲模式）成象，所用基片为新剥离的云母片 ， 蛋 白 液 通 过 静 电 作 用 结 合 在 经 过 处 理 的 云 母 表 面 ， 其 异 相 界 面 的 存 在 环 境 与其 在 膜 上 的 环 境 具 有 相 似 性 。圆 二 色 谱 法 是 测 定 蛋 白 质
9、 结 构 的 一 种 重 要 手 段 。 不 管 是 在 远 紫 外 区 还 是 近 紫外 区 ， CD 光 谱 均 可 被 经 验 地 作 为 特 定 蛋 白 的 “指 纹 ”数 据 。 本 实 验 选 择 测 定 样品 蛋 白 在 远 紫 外 区 的 圆 二 色 谱 来 研 究 其 二 级 结 构 特 征 及 含 量 。最 后 本 论 文 研 究 了 样 品 蛋 白 的 生 物 学 活 性 。 本 实 验 选 择 操 作 简 单 、 重 复 性 好的 MTT 法抗癌药物敏感试验检测黄鳝血清转铁蛋白对白血病细胞株的作用。实验 室 首 先 对 白 血 病 细 胞 株 进 行 培 养 ， 然 后
10、 进 行 MTT 实验。通 过 生 物 质 谱 测 试 ， 确 定 SDS-PAGE 中 分 子 量 较 大 的 蛋 白 为Serotransferrin， 即 血 清 转 铁 蛋 白 。 该 转 铁 蛋 白 分 子 量 为 74kD，含 -螺 旋 29.8%， -折 叠 6.6%。 黄 鳝 血 清 转 铁 蛋 白 对 白 血 病 细 胞 株 无 明 显 生 物 学 活 性 。关键词：黄鳝; 蛋 白 质 ;生 物 活 性 ;SDS-PAGEAbstractExtraction, separation and purification of biological macromoleculespl
11、ay an important prerequisite in the development of its function forwhich we explore the phenomenon of life in the organism and thusexploit its biological activity. Firstly, we extracted the serum from theMonopterus albus fresh blood, from which we salted out respectivelywith (NH4) 2SO4, Na2SO4 and c
12、aprylic acid - (NH4) 2SO4 solution for theextraction of crude protein which we purified by the anion exchangecolumn chromatography (filler DE52). The purity and molecular weightof protein samples were determined by SDS-PAGE gel electrophoresis.The use of LTQ-MS analyzed and identified the sample pro
13、tein, of whichwe researched the database and compared the sequence todetermine species, the gene sequences and the precise molecularweight. Then we characterized the physical and chemical properties ofthe protein. We used the atomic force microscopy to characterized theprotein surface topography and
14、 our probe micro-cantilever is an oxideetching silicon cantilever. The circular dichroism instrument was used tocharacterize the secondary structure of the eel serum transferrin. Themeasurement range of the sample protein solution is the far-ultravioletregion, which means 190-260nm. Finally, we did
15、a simple preliminaryexploration about the biological activity of the protein. We selected aMTT assay which possessed plain operation and good repeatability. Wemainly tested anti-cancer drug sensitivity of the protein on leukemia celllines.Eel (Monopterus albus), belongs to Monopterus, Synbranchidae,
16、Synbranchiformes. The swamp eel Monopterus albus is widelydistributed in tropical and subtropical freshwaters ranging fromSoutheast Asia to East Asia, have a large distribution in the southeastregion of our country, Thailand, Indonesia and other Southeast Asianregion. Monopterus albus Zuiew is favored by many consumers in theworld， beeause it has a plenty of nutrition， meat delieious and has someamino acid
