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1、中国农业大学硕士学位论文猪体细胞克隆及相关生物技术的研究姓名：林平申请学位级别：硕士专业：动物遗传育种与繁殖指导教师：曾申明20030601摘要本文系统研究了猪体细胞核移植技术的相关环节，并对其中的某些条件进行了优化。初步建立了相关的技术体系，为后期实验的开展奠定了坚实的基础。本实验建立了小香猪耳上皮细胞、胎儿成纤维细胞和荣昌猪耳上皮细胞、颗粒细胞三种体细胞细胞系。在实验中初步探索了在体外条件下对上述三种细胞进行原代培养、传代培养、细胞纯化、细胞周期同期化处理及冷冻保存的方法。结果表明三种细胞的培养效果均与接种密度有关。颗粒细胞对此尤为敏感，当接种密度低于5 1 0 4 m l 时，很难达到汇
2、合期并继续传代。耳上皮的分生能力最强。胎儿成纤维细胞则介于援者之间。冷冻对细胞有损伤，解冻后有近5 0 的细胞死亡且第一次传代时细胞的生活力明显下降，袭现为生长速度降低，但在后续的传代过程中可以恢复。我们还通过脂质体介导法获得了转绿色荧光蛋白( G F P f l e o “) 基因的胎儿成纤维细胞系，并初步比较了不同浓度G 4 1 8 及筛选方法对细胞纯化效果的影响。结果表明在一定范围内阳性率随基因量的增加而增加。传代培养时向培养液中添加3 0 0 9 9 m lG 4 1 8 可获得较好的筛选效果。在融台过程中，我们发现当场强为1 2 0 V l m m 。脉冲对程由2 0 泌提高到3 0
3、 I l s 和4 0 p s 后，囊胚率有显著提高( 3 3 v s 7 8 和3 3 v s 7 2 ，p 0 0 5 ) 。在高c d + 融合条件下，融合胚胎再进行电激活处理会导致猪颗粒细胞核移植胚骀发育潜力下降，卵裂率、囊胚率和平均囊胚细胞数分别为5 0 5 、1 9 2 和2 4 7 。但与不激活组( 6 2 O ，1 9 3 和2 7 8 ) 无统计学差异( p 0 0 5 ) 。在孤雌激活实验中还发现激活液中不同c d + 浓度对猪体外成熟卵母细胞孤雌激活效果有显著影响。虽然低C a ”浓度激活的卵母细胞卵裂率稍高，但高C a 2 + 激活的囊胚率和囊胚细胞数均有显著的提高(
4、8 5 v s l 6 1 和2 2 4 v s 3 0 4 ，p O 0 5 ) 2A na d d i t i o n a la c t i v a t i o nt r e a t m e n ta f t e rf u s i o nd i dn o ti n c r e a s et h ep e r c e n t a g e so ff u s i o n ，c l e a v a g ea n db l a s t o c y s ta sw e l la st h ec e l ln u m b e ro ft h eb l a s t o c y s tw h e nt h
5、 eg r a n u l a rc e l l sw e r ef u s e dt oe n u c l e a t e do o c y t e si nt h em e d i u mc o n t a i n i n g1 O m MC a ”O u rr e s u I t ss h o w e dt h a ta c t i v a t i o ns t i m u l a t i o nw a sd e t r i m e n t a lt ot h ef u r c h e rd e v e l o p m e n to fc l o n i n ge m b r y o s
6、 W h e np o r c i n eI V Mo o c y t e sw e r ee l e c t r o a c t i v a t e di nt h em e d i u mc o n t a i n i n g1 0 r a MC a 。+t h eb l a s t o c y s tr a t ea n dt h ec e l ln u m b e ro fb l a s t o c y s tw e r es i g n i f i c a n t l yi n c r e a s e d ( 1 6 ，1 v s 8 5 a n d3 0 4 v s 2 2 4 ，
7、p 0 0 5 ) ，但都高于耳上皮细胞( 其融合率和卵裂率分别为4 8 I 和1 7 9 ) ，差异显著( p 0 0 5 ) a在高C a ”融台条件下，融合胚胎再进行电激活处理会导致猪颗粒细胞核移植胚胎发育潜力下降，卵裂率、囊胚率和平均囊胚细胞数分别为5 0 5 、1 9 2 和2 4 7 ，但与不激活组( 6 2 O 1 9 3 和2 7 8 ) 无统计学差异。激活液中不同C a ”浓度影响猪体外成熟卵母细胞的孤雌激活效果。C a ”浓度为0 0 5 r a M时，激活后的卵母细胞卵裂率稍高但当C a 2 + 浓度提高到1 0 m M 激活后的囊胚发育率和囊胚细胞数均有显著的提高( 8
8、 5 v s l 6 1 和2 2 4 v s 3 0 4 ，p O 0 5 ) ，但分别与耳上皮细胞的对应结果差异显著( p 0 0 5 ) 。在囊胚率和囊胚细胞数方面颗粒细胞与耳上皮细胞的对应项差异显著( p O ，0 5 ) 。因此在高钙融合条件下额外的电激活处理是不需要的。2 5 不同C a 2 + 浓度对猪体外成熟卵子孤雌激活效果的影响表3 - 5 不同c ，浓度对猪体外成熟卵子孤雌激活效果的影响旦墅垡g i 墅竺坐兰2 1 1 1 1 1 1 兰i 塑2 巴生! E ! 竖i 坚已! 堂! 1 2 曼! ! ! ! i ! ! ! ! 蔓壁r 。2 + 赫詹卵子数卵裂数( )囊胚数
9、( )囊胚细胞数C a 2 + C O l i c e n 仃a t i o nN o - o fO O c y t e sN o o f o o c y t e sN o - o fN o o f c e l l si na c t i v a t e dc l e a v e d ( )b l a s t o e y s t s ( )b l a s t o c y s t s 0 ，0 5 ( m M )9 64 8 97 ( 8 5 ) a2 2 4 5 ：1 6 “ 1 0 ( r a M )1 1 64 4 41 9 ( 1 6 1 ) 53 0 4 + 1 0 8注：n = 3
10、，同列内大写上标不同袭示差异投显著( P 0 0 5 ) 。当脉冲时程增加到3 0 9 s 后，囊胚发育率显著高于2 0 坤组( P 0 0 5 ) ，而且卵裂率和囊胚率均出现下降趋势。因此，以克隆胚胎的早期发育为标准，我们认为在高钙融合条件下额外的屯激活处理是不需要的。C h e o n g 等( 2 0 0 2 ) 的核移植实验也得出了类似的统计学规律。这可能是由于融合液中c a 2 + 浓度的提高使得在电场参数不变的条件下，融合过程对重组胚的激活作用大大增强。因此，在高c a ”条件下，额外电刺激不但不能显著提高克隆胚胎的发育率，还有可能对胚胎发育产生负面影响。C o l l a s 等
11、( 1 9 9 3 ) 就曾指出不足或过量的c 一+ 刺激都对胚胎发育有害。哺乳动物卵子的激活与钙离子有密切的联系。电激活时，胞外C a ”内流可诱发胞内C a 2 +的释放，从而激活卵子( S u ne ta 1 ，1 9 9 2 ) 。在实验五中，我们进一步考察了c a 2 + 浓度对猪体外成熟卵母细胞孤雌激活的影响。结果表明，在电参数相同的条件下( D C1 3 0 V m m ，8 0 I | t s 1次) ，提高激活液中的C a “浓度可显著提高孤雌激活后的囊胚率和囊胚细胞数( p 0 0 5 ) 。 C h e o n g 等( 2 0 0 2 ) 研究发现在孤雌激活的对照组中，
12、用含1 O m MC a “的激活液处理的卵子有约4 7 形成2 个假原核，而用含0 I m MC a 2 + 的檄活液激活的卵子9 0 形成1 个假原核并排出1个极体也就是说是单倍体形式，这也许是在低钙溶液中，卵子孤雌激活后发育率不高的原因之一。4 小结1 冷冻的体细胞解冻后可以直接作为核移植的供体细胞。2 场强1 2 0 v m m ，脉冲时程3 0 p s 或4 0 “s ，间隔l O O m s 的两个支流脉冲，可有效的对猪核移植胚胎进行融合处理。3456提高融合液中的C a ”浓度可显著的促进猪桉移植胚胎的融合率、卵裂率和囊胚发育率的提高。供体细胞种类对猪核移植胚胎的融合率、卵裂率、
13、囊胚发育率及囊胚细胞数有显著的影响。随着细胞分化程度的提高，其克隆潜力逐渐下降。胎儿成纤维细胞和颗粒细胞是猪核移植胚胎的理想供体细胞。在高C a “融合条件下，额外的电激活刺激不能有效的促进核移植胚胎的体外发育潜力。提高激活液中的C a ”浓度可显著的提高猪体外成熟卵子的孤雌激活囊胚发育率与囊胚细胞数。中国农业大学坝士学位论文猪体细胞克隆及相关技术的研究参考文献A b e y d e e ra ，L R W a n gW ：P r a t h e rR S ，D a yB N ( 1 9 9 8 ) M a t u r a t i o ni nv i t r oo f p i go o c y
14、 t e si np r o t e i n - f l e em e d i a ：F e r t i l i z a t i o na n ds u b s e q u e n te m b r y od e v e l o p m e n ti nv i t r o 。B i 0 1 R e p r o d ，5 8 ：1 31 6 1 3 2 0 A k a g i ，S ，T a k a h a s h iS ，Y o k o t aM ，e ta 1 n l et i m i n go ff u s i o na n dc h e m i c a la c t i v a t i
15、o ni nn u c l e a rt r a n s f e ra f f e c t sd e v e l o p m e n tp o t e n t i a lo f b o v i n ee m b r y o s T h e r i o g e n o l o g y2 0 0 1 ；5 5 ：2 5 2A m a n o ，T T a n i ，T ，K a t o ，Y e ta l ( 2 0 0 1 ) M o u s ec l o n e df r o me m b r y o n i cs t e m ( E s ) c e l l ss y n c h r o n
16、i z e di nm e t a p h a s ew i t hn o c o d a z o l eJE x pZ o o l2 8 9 ，1 3 9 - 1 4 5 A s h w o r t h DB i s h o pM ，C a m p b e l lK ，e ta 1 D N Am i s c r o s a t e l l i t ea n a l y s i so fD o l l y N a t u r e1 9 9 8 ；3 9 4 ：3 2 9 B a g u i s i ，A ，B e h b o o d iE ，M e l i e a nD T e ta t P r o d u c t i o no fg o a t sb ys o m a t i cc e l ln u
