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1、1大学本科毕业论文大学本科毕业论文( (设计设计) )开题报告开题报告学院： 专业：生物科学 级别：级课题名称 牡丹病原菌的研究牡丹病原菌的研究学生姓名学号指导教师姓 名职称学位博士21 1、选题的理论、实际意义选题的理论、实际意义牡丹为我国传统名花,也是世界上著名的花卉之一。素有“国色天香”之美誉。牡丹除了具有较高的观赏价值外还具有较高的药用价值。以其根皮供药用，习称丹皮，是一种贵重的中药材，具清热、活血、行瘀1的作用。在中国, 栽培历史悠久, 栽培规模巨大,。在六盘水以六枝中药材种植基地为牡丹栽培生产中心。随着牡丹品种增多、生产面积的扩大, 病害问题也日益突出, 严重影响了牡丹的正常生长发
2、育、种苗质量和开花质量, 降低了牡丹的观赏效果, 影响了牡丹的产业化发展。因此，开展牡丹病害的防治研究显得极为重要。据作者调查和有关文献记载, 牡丹的病害有红斑病、根腐病、根结线虫病、炭疽病、灰霉病、黄斑病、轮纹斑点病、锈病、白粉病等 2 3。其中红斑病、黄斑病、轮纹斑点病、炭疽病主要危害牡丹叶片。2 2、研究动态、见解、研究动态、见解有关牡丹的专著中仅有少量内容涉及到牡丹病害, 其他很难找到相关资料。在国外, 日本和法国牡丹品种繁多、栽培面积巨大,但很少有关于牡丹病害的研究资料。国内对牡丹病害的研究主要集中在几种病害上, 比如牡丹根腐病、牡丹红斑病、牡丹线虫病等 4- 6 。新品种的引进、催
3、花牡丹和盆栽牡丹的大量繁殖, 都会引起牡丹新病的发生。国内对于病害种类的普查 也不十分全面, 因此,有必要对牡丹病害进行系统研究, 了解牡丹病害的发生种类、病害的发展规律, 以便为牡丹生产实践中病害的有效防治。 牡丹红斑病 牡丹红斑病 ( 又称牡丹叶霉病) 是牡丹上的主要病害之一, 发生严重, 研究资料较多。对牡丹红斑病的研究主要集中在病害的分布和危害、危害症状、发生发展规律、病原菌的生物学性以及防治病害药剂的筛选等方面 6- 14。牡丹炭疽病 15, 16 主要危害叶、花梗、叶柄及嫩枝。叶片染病时, 叶面出现褐色小斑点, 逐渐扩大成圆形至不规则形大斑, 大小一般为 4 25 mm, 发生在叶
4、缘的为半圆形, 病斑扩展受主脉及大侧脉限制, 病斑多为褐色, 有些品种叶斑中央灰白色, 边缘黄褐色, 后期病斑中央开裂, 有时呈穿孔状。7、8 月份病斑上长出轮状排列的黑色小粒点, 即病原菌的分生孢子盘, 湿度大时分生孢子盘内溢出红褐色黏孢子团, 成为识别该病的病征。牡丹轮纹斑点病 16主要危害牡丹叶片, 初发病时叶片上病斑圆形或近圆形,直径 4 10 mm, 数量多, 淡褐色至灰白色, 边缘褐色, 老病斑有明显的同心轮纹, 病斑中央生灰黑色霉状物, 即病菌的子实体, 其病原菌为黑座假尾孢 。牡丹黄斑病 16 主要危害牡丹的叶片, 病斑圆形或近圆形, 浅黄褐色至黄褐色, 边缘紫红色, 大小 3
5、 5 mm , 后期病斑上散生小黑点,即病原菌的分生孢子器, 其病原菌为斑点叶点霉。通过寄主牡丹叶病斑的研究，能对牡丹病害今后的研究方向提出了建议。3 3、研究思路、方法、技术路线、研究思路、方法、技术路线3.1 标本采集 3.1.1 采集地点:六盘水六枝中药材种植基地3.1.2 采集方法: 在感病植株上分东西南北四个方位, 每个方位采集 2 枚感病叶， 枚。每次株, 共 个样品, 总计 个样品。33.2 病原菌鉴定及分离纯化3.2.1 病原菌形态初步鉴定:3.2.1.1 解剖镜下对采集的每片牡丹叶进行镜检，选取牡丹病害叶上长势良好的孢子镜检，并用记号笔做好标记。3.2.1.2 挑取孢子，制成
6、临时装片，在显微镜下观察其形态。3.2.1.3 测量牡丹寄主细胞上孢子大小、分生孢子梗、产孢细胞的大小。3.2 分离方法 ：3.2.1 单孢分离： 将病斑叶上的若干个孢子制成孢子悬浮液均匀涂布水琼脂平板。3.2.2 纯化菌株：单孢纯化后菌株继续置于( P DA) 培养基上,培养到一定时间后观察培养性状, 镜检形态特征。解剖镜下观察菌落生长情况, 描述菌落形状、测量单孢分离后的孢子大小、直径。进行显微镜计测和照相。3.3 病原菌形态学鉴定：病原菌形态学鉴定： 3.3.1 活化菌株：将纯化后的菌株重新转皿到 PDA 培养基上培养。3.3.2 生物学特性测定温度测试：用直径 3mm 的打孔器打取在
7、PDA 培养基上培养 7 天的病原菌菌饼, 移至新新的PDA 平板培养基上培养。置于 5、10、15、20、25、30恒温箱中, 培养 96 小时, 测量菌落直径及照相。3.3.3 药效筛选：3.3.3.1 牡丹红斑病牡丹红斑病防治试验供试药剂：70 甲基托布津可湿性粉剂；50 多菌灵可湿性粉剂；75 百菌清可湿性粉剂；80 代森锰锌可湿性粉剂；25 甲霜灵可湿性粉剂；80 代森锌可湿性粉剂；110 苯醚甲环唑（世高）水分散粒剂；69安克锰锌水分散粒剂。不同药剂对红斑病病原菌的室内毒力测定供试病原菌：红斑病病原菌将分离牡丹植株上的红斑病病 原菌经平板纯化培养，配制分生孢子悬浮液。试验方法： 分
8、别对上述种农药以灭菌水稀释成相应的倍数液。3.3.3.2 不同杀菌剂对牡丹炭疽病室内毒力测定室内试验设置 5 种药剂, 供试药剂有 50% 咪鲜胺 WP ( 施保功, 拜耳作物科学公司产) , 50% 多菌灵 WP ( 上海升联化工有限公司产) , 70% 甲基硫菌灵 WP, 70%代森锰锌 WP , 75% 百菌清 WP , 将供试药剂分别用无菌水 ( 百菌清、咪鲜胺) 、盐酸 ( 多菌灵) 、二甲基亚矾 ( 代森锰锌) 、甲醇 ( 甲基硫菌灵) 配成一定浓度的母液, 加入到不同量的 P DA 培养基中, 制成 500 倍、1 000 倍、1 500 倍含药培养基, 以加入成 500 倍、1
9、 000 倍、1 500 倍含药培养基, 以加入等体积的无菌水、甲醇、盐酸和二甲基亚矾的 PDA 平板为对照, 3 个浓度水平共 15 个处理, 每个处理 5 次重复, 25下培养 8 d 后, 参照文献 17,18 的方法, 测量菌落生长直径, 计算抑制率并观察菌落特征。生长抑制率 ( % ) = 1- ( 处理菌落直径 - 菌饼直径) / ( 对照菌落直径 - 菌饼直径)43.3.3.3 分子系统学IT S 测定：将单孢纯化好的菌种移植于 PAD 平板培养基上, 置黑暗条件 25培养 5 7 d, 待菌落大到直径为 5 6 cm 时, 停止培养. DNA 提取方法参照文献 , 采用引物 I
10、T S5 和 IT S4 对 rDNA 的 2 个内转录间区和 5. 8S 区约 600 个碱基对进行扩增 , PCR 产物测序由上海申能博彩公司用 Go3S PCR 产物纯化盒( Go3SP CR product pur if icat ion kit V3. 0) 纯 化, 在 ABI377 自动 测序仪上直接 测序. 测序 引物为 IT S5 和 IT S4, 测序后经拼接得到约 600 个碱基的序列片段( 包含一段 18S 基因的尾部和一段 28S 基因的头端) . DNA 测序：使 用 ClustalX 软件对自测序列及从 GenBank 下载的相关序列共计 44 个进行序列比对(
11、alignment ) , 比对后的 IT S1 5. 8S rDNA IT S2 序列为 545 个碱基( 含缺失位点) , 其中有 114 个简约性信息位点.4、总体安排、进度计划总体安排、进度计划2011 年 9 月2012 年 7 月 标本采集2012 年 7 月2012 年 9 月 病原菌鉴定及分离纯化2012 年 11 月2013 年 4 月 分子系统学分析、药效筛选、最适温度实验。5、主要参考文献主要参考文献1邓才富，申明亮，章文伟牡丹紫纹羽病病原菌的生物学特性及其防治J中国农学报，2007(5)2蒋立昶，赵孝知菏泽牡丹栽培技术M天津：天津科学技术出版社19963徐明慧 花卉病虫
12、害防治M北京：金盾出版社19934俞思佳，张佐双， 雷增普北京地区牡丹和芍药主要病害的综合防治 J 北京林业大学学报，1993(2)5于梅娥，林晓民牡丹病虫害种类的研究 J 检验检疫科学，2002(6)6蓝保卿， 李嘉钰，段全绪 中国牡丹全书M北京：中国科学技术出版社20037 喻璋牡丹、芍药的六种真菌病害研究初报 J 河南农业大学学报, 19871(4).8张宗岩牡丹叶斑病的初步观察及防治 J中国园林,199(4)9牛迎福，柴义生牡丹红斑病发生规律及防治技术研究 J山东林业科技，1998(2)10季延平，牛迎福牡丹红斑病病原菌的研究 J山东林业科技，2001(1) 11吴玉柱，季延平，刘慇牡
13、丹红斑病发病规律的观察 J中国森林病虫, 2004(5)12吴玉柱，季延平，刘慇牡丹红斑病的研究 J林业科学研究, 2005(6)13吴玉柱，季延平，刘慇牡丹的主要病害及其防治研究 J 西部林业科学，2006(4)14吴玉柱，季延平， 刘慇牡丹红斑病药剂防治实验 J林业实用技术，2004(7)15薛杰，郭霞，马书燕菏泽牡丹主要病害的发生与防治 J林业实用技术, 2005(4)16段春燕，郑跃进，薛娴牡丹主要病害的识别 J中国植物导刊，2007(8)17詹儒林，李伟，郑服丛芒果炭疽病菌对多菌灵的抗药性 J植物保护学报，2005 ( 1)18尹敬芳，刘西莉，李健强 9 种杀菌剂对不同来源辣椒疫霉病菌的毒力比较初探 J植物病理学报，2005(1)5指导教师意见：签 名：年 月 日
