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1、 0中央研究院高中生命科學資優生培育計畫 專題研究報告 中央研究院高中生命科學資優生培育計畫 專題研究報告 斑馬魚胚胎發育時期中樞經系統與單羧基運輸蛋白之相關性 斑馬魚胚胎發育時期中樞經系統與單羧基運輸蛋白之相關性 作者：台市第一子高級中學 徐婕芯（94013） 台市第一子高級中學 陳佩君（94009） 台市第一子高級中學 黃暐琇（94030） 指導師：黃鵬鵬 教授（中央研究院細胞與個體生物學研究所） 作者：台市第一子高級中學 徐婕芯（94013） 台市第一子高級中學 陳佩君（94009） 台市第一子高級中學 黃暐琇（94030） 指導師：黃鵬鵬 教授（中央研究院細胞與個體生物學研究所） 1斑
2、馬魚胚胎發育時期中樞神經系統與單羧基運輸蛋白之相關性 英文摘要（Abstract） 斑馬魚胚胎發育時期中樞神經系統與單羧基運輸蛋白之相關性 英文摘要（Abstract） Astrocytes provide energy to neuron mainly with lactate, which is transported through monocarboxylate transporters (MCTs). Among 14 isoforms of MCTs reported in mammals, only MCT1, 2 and 4 are expressed in brain and
3、 the three isoforms are found to differentially expressed in neuron and astrocyte, respectively. Based on these, “astrocyte-neuron lactate shuttle has been proposed. However, no in vivo evidence was available so far to support this hypothesis. In the present study, zebrafish was used as a model to p
4、rovide in vivo molecular physiological evidence for the involvements of MCTs in the development and functioning of central nervous system (CNS). Full-length cDNAs of the zebrafish MCT1-4 were cloned from zebrafish. Based on RT-PCR results, zMCT1 and zGLUT4 expressed in brain were chosen for further
5、experiment. Morpholino knockdown experiments provided for the 1st time the in vivo evidence to indicate that the zMCT1 and zMCT4 may be involved in energy translocation and functioning of the developing CNS. 摘要 摘要 於前人預備實驗中，發現斑馬魚胚胎時期肝醣訊號會於腦部與中樞神經系統區位出現。因此，醣的分布與在細胞間的傳遞應可視為腦部發育的重要指標。 我們以基因體資庫為工具，研究斑馬魚腦
6、部相關基因構型分布。目前，我們選殖到個葡萄運輸 (GLUT)、鈉子/葡萄協同運輸(SGLT)與單羧基運輸(MCT)通道在斑馬魚腦部表現，其表現是否與胚胎初期中樞神經系統的發育相關仍未知。 經過初步基因分析後，我們決定以 MCT 中第一和四構型作為研究對象，並用 Anti-Hu，與 PCNA 做神經觀測，將施打反股寡核苷酸進突變操作的斑馬魚，與對照組進免疫染色分析，以螢光顯微鏡觀察發現：抑制 MCT 表現，確實影響胚胎時期中樞神經細胞發育及鰓部細胞分；亦可能造成畸形出現。 壹壹、研究動機 研究動機 在生物的胚胎時期，腦部及中樞神經的發育完全與否，可以是左右該生物未生長的2極重要因素。於生命科學上
7、冊第一章(1-2)中，我們學到細胞內的化學組成，以及擴散、滲透和膨壓的機制。另外，於高一基礎生物中，我們學知：三磷酸線苷(ATP)是所有細胞維持正常活動能的源，其可由肝醣分解而的葡萄(glucose)與乳酸(lactate)供應。然而，脊椎動物胚胎時期的腦部及中樞神經細胞，於發育時期所需的龐大養分，究竟是如何有效自循環系統中運輸而與分配呢？假如把這些碳水化合物/能運輸通道阻斷，又將對該生物胚胎時期，甚至中樞神經系統的發育造成何種影響呢？這些在在均是未解且人好奇的謎團！ 以下（圖一）即舉單羧基運輸蛋白(monocarboxylate transporter, MCT)及葡萄運輸通道(glucos
8、e transpoter, GLUT)為，明本實驗之主角碳水化合物/能運輸通道，於哺乳動物體內的位置、運輸物質，及其於生物體中作用之方法、程。 仔細考慮未實驗動物所應具備的特質後，我們決定選用斑馬魚(Danio rerio)作為研究對象，原因如下：斑馬魚繁殖能強、雌性斑馬魚產多（一次100200 個）、飼養容、體積小、發育時間短（從受精到孵化只需48 小時）；除此之外，重要的有：其胚胎透明，觀察到藥物對其體內器官的影響；胚胎在24小時內就可發育成形，這使得我們可以在圖一 中樞神經系統(Central nervous system, CNS)能運輸模式。葡萄(Glucose)藉 由葡萄運輸通道(
9、glucose transporter, GLUT)自微血管運輸至神經元(Neuron)與 星芒細胞(Astorcyte) 。下游代謝產物-乳酸(Lactate)藉由單羧基運輸蛋白 (monocarboxylate transporter, MCT)在細胞間傳遞運輸。 3同一代魚身上進同的實驗；然而，最重要的是：斑馬魚的基因體序資庫(genome database)完整，且其基因與人基因相似性高達87%！這意味著在其身上做藥物實驗所得到的結果，在多情況下也適用於人體。基於上述原因，我們選定牠為實驗材。 貳、研究目的 貳、研究目的 解 pyruvate 與 lactate 等所謂單羧基代謝產物對
10、於胚胎發育時期神經細胞的發育與功能維持 。 、研究設備及器材 、研究設備及器材 1. 斑馬魚（zebrafish、Danio rerio） 2. 米分光光儀 (照片一) 3. 小型電泳槽 (照片二) 4. PipetmentTip (照片三) 5. 28斑馬魚受精恆溫培養箱 (照片四、照片五) 6. 循環水浴槽 7. 37恆溫箱 8. 洋菜膠 9. PCR tube 10. PCR Machine (照片) 11. Orbital Shaker (照片七) 12. 解剖顯微鏡 (照片八) 13. 心機 (照片九) 14. 正螢光顯微鏡 15. 顯微注射機 (Microinjector) 16.
11、 反股寡核苷酸morpholino（MO） 17. Phosphate Buffer Saline (PBS) 18. Bovine Serum Albumin (BSA) 19. 單株抗體 (Anti-Hu-FITC: 發散螢光的神經發育細胞表現蛋白及增生細胞核抗原(Proliferating-cell Nuclear Antigen, PCNA) 25 mM Tris-HCl, 0.25 mM sucrose, 20 mM EDTA, 0.4% NaDeoxycholate, pH=7.0) 與蛋白質分解酶抑制劑 (Sigma, USA)。倒入玻璃研磨管 (Potter-Elvehjem
12、homogenizer)，以600 rpm的轉速回20次進研磨後，4下13,000 rpm心30分鐘，去除細胞雜物，過程中須保持低溫。心後吸取上清液分裝，存放於-80冰箱中，在2週內進蛋白質分析。 2. 蛋白質定照Bradford (1976) 的方法，將均質溶液稀釋2000倍，用小牛血清為標準液，再加入蛋白質染劑，以波長595 mm的分光光計測並定。 （二）實驗3-2 西方墨點分析法 1. 每個樣本取蛋白質40g，做濃為6% SDS聚丙烯醯膠電泳分析 (SDS polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)。 2. 採用Tricine-sodium
13、 dodecyl sulfate電泳系統，在均質後的蛋白質樣本中加入5倍濃的sample buffer，於37加熱10分鐘後，以SDS-PAGE進電泳，直至染劑到達凝膠底部。 （三）實驗3-3 免疫轉印分析 1. 經由SDS-PAGE電泳後之膠體，用Transfer buffer以電氣轉印裝置 將凝膠所分之蛋白質轉印到Immobilon-P membranes (Millipore, USA) 上，以100伏特40安培進轉印4小時後，經blocking solution (5% nonfat powdered milk in PBST, Phosphate buffered saline su
14、pplemented with Tween 20; 140 mM NaCl, 3 mM KCl, 10 mM Na2HPO4 and 2 mM KH2PO4, 0.2% Tween 20, pH=7.4) 反應至少2小時以上，加入PBST buffer沖洗10分鐘，重複3次，以1000倍稀釋的Hu-protein鼠單株抗體 ，反應2小時，以PBST清洗3次10分鐘後，再分別與Goat anti-mouse IgG-AP 11conjugated二級抗體 (Immuno Reseach, USA) (1000倍稀釋) 室溫進雜合2小時，以PBST清洗3次10分鐘後，加入alkaline phos
15、phate substrate buffer ( 100 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl and 5 mM MgCl2, pH=9.5) 潤濕平衡1分鐘，最後以NBT (nitroblue tetrazolium salt) 和BCIP (5Bromo-4-Chloro-3-Indolyl phosphate) substrate kit (Zymed, SF, California, USA) 為受質呈色。 2. 於顯色過程後用甲醇去除過染色而完成適當之顯色。免疫呈色最後取影像並存成TIFF 檔案，用商業軟體 (Image-Pro Plus, Version 1.2, Me
16、dia Cybernetics, Silver Springs, MD., 1994) 進分析和判，將結果轉換成據以比較免疫反應的濃 。 伍、研究結果及討 伍、研究結果及討 一、研究各通道基因在各組織中的表現程（實驗1-4）的結果（圖四）： 我們對所有的碳水化合物與乳酸通道進檢測，並以腦部為主要討及觀察的器官，發現sglt1a、sglt2幾乎無表現。這與一開始實施此實驗之目的：探討碳水化合物/能運輸通道的表現與腦部 / 中樞神經系統發育之關係符，因為其於未被抑制前就已無表現。因此，鈉子/葡萄協同運輸通道(Na+-dependent glucose co-transporter, SGLT)被剔除出未待續的實驗。 至於葡萄運輸通道(glucose transpoter, GLUT)與單羧基
