酶工程考试重点

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1、WHUWHU 生科院生科院 酶工程考试重点酶工程考试重点 蝉蝉 整理整理 O(_)OO(_)O 生物催化剂：生物催化剂： 1. 更高的催化效率：酶催化的反应速率是相应的无催化反应速率的 1081020 倍，并且 至少高出非酶催化反应速率几个数量级。 2. 更高的反应专一性：酶分子特定的空间结构决定了其特定的底物专一性。 3. 温和的反应条件：一般的化学催化往往需要高温、高压和极端的 pH 条件。 4. 具有调节能力：许多酶的催化活性可受到多种调节机制的灵活调节，如别构调节、酶 的共价修饰调节、酶合成与降解的调节。 5. 酶的本质是蛋白质：易变性和降解。酶：酶： 酶是一种高效、高度专一、和生命活

2、动密切相关的、蛋白质性质的生物催化剂。 1）所有的酶都是由生物体产生的（甚至病毒） 2）酶和生命活动密切相关 a. 酶参与了生物体内所有的生命活动和生命过程 执行具体的生理功能 清除有害物质，起保护作用 协同激素等生理活性物质在体内发挥信号转换、传递和放大作用，调节生理过程和 生命活动。 催化代谢反应，建立各种各样代谢途径和代谢体系。 b. 酶的组成和分布是生物进化与组织功能分化的基础 c. 酶能在多种水平上进行调节以适应生命活动的需要酶的本质：酶的本质： 酶的化学本质是蛋白质. 绝大部分酶是蛋白质。或主要是蛋白质为核心的酶作为催化剂，但随科学发展不排斥 有其他类型的催化剂存在。酶的分类酶的分

3、类: :类型种类催化作用类型氧化还原酶类 570 种RH + R (O2)=R + RH( H2 O) 转移酶类 490 种RG + R=R + RG 水解酶类 560 种RR + H2O=RH + ROH裂合酶类（解合酶类） 240 种RR=R + R 异构酶类 85 种R=R 合成酶类（连接酶类） 80 种R+R+ATP=RR+ADP (AMP) +Pi(PPi) 活性中心：活性中心： 酶分子上与催化活性直接相关的少数氨基酸残基组成的催化区域,称作酶的活性中心(active center). 包括结合部位(binding site)和催化部位(catalytic site)。 1. 活性中

4、心在种系进化上的严格保守性 2. 酶活性中心构象的维持依赖于酶分子空间结构的完整性3. 酶活性中心各基团的相对位置得以维持,就能保全酶的活力比活力：比活力：酶的比活力（specific activity）：每毫克蛋白所含的酶单位数，用 U/mg 蛋白表示。活力：活力： 酶活力（enzyme activity）也称为酶活性，是指酶催化一定化学反应的能力。酶活 力的大小可用在一定条件下，酶催化某一化学反应的速度来表示，酶催化反应速度愈大， 酶活力愈高，反之活力愈低。 酶活力单位，一个标准单位：在特定的条件下（25，pH、底物浓度等其他条件均为 最适条件） ，1 分钟能转化 1 微摩尔底物所需的酶量

5、。 酶的转换数： 1.分子活性定义：在最适条件下，每摩尔酶每分钟所转变的底物摩尔数（即每摩尔酶 的酶单位数） 。 2.对于寡聚酶：在最适条件下，每摩尔活性亚基或催化中心每分钟所转变的底物摩尔 数。 3.用 min-1 表示。4.kcat=Vmax/EtKmKm： 酶反应动力学常数 Km，相当于反应达到最大速度一半时的底物浓度，或者说，相当于 要使反应系统有一半的酶分子参加反应所必须具有的底物浓度。 物理意义： 特定的反应，特定的反应条件下，Km 是个特征常数，可部分描述酶反应性质、反应条 件对酶反应速度的影响。故可用来鉴别不同的酶。 1/Km 表示酶与底物的亲和力，Km 越大，亲和力越小，反之

6、越大。 当v=V/2 时，Ks=S。表明Km 相当于反应达到最大速度一半时的底物浓度，或者说， 相当于要使反应系统有一半的酶分子参加反应所必须具有的底物浓度。 通过Km 可判断酶的最适底物，因为最适底物具有最大的V/Km。 通过Km 可了解酶的底物在体内可能具有的浓度水平。一般酶Km,那么vV，S将失去其生理意义。 通过体外测定某些物质对Km 的影响，可以推断出该物质可能有的生理效应，如作为抑 制剂或活化剂等。酶合成的基因调节控制理论：酶合成的基因调节控制理论： 操纵子学说（operon theory） 操纵子基因表达的协同单位： a.结构基因（编码蛋白质, structural gene,

7、S） ； b.控制部位：操纵基因（operator gene, O） ；启动子（promotor gene, P） 1.调节基因(regulator gene)： 可产生一种组成型调节蛋白(regulatory protein) （一种变构蛋白） ，通过与效应物 (effector) （包括诱导物和辅阻遏物）的特异结合而发生变构作用，从而改变它与操纵基 因的结合力。调节基因常位于调控区的上游。 2.启动基因（promotor gene） （启动子）：有两个位点： （1）RNA 聚合酶的结合位点 （2）cAMP-CAP 的结合位点。 CAP：分解代谢产物基因活化蛋白（catabolite gen

8、e activator protein） ，又称环腺苷酸 受体蛋白(cAMP receptor protein，CRP） 。 只有 cAMP-CRP 复合物结合到启动子的位点上，RNA 聚合酶才能结合到其在启动子的位 点上，酶的合成才能开始。 3.操纵基因（Operater gene）:位于启动基因和结构基因之间的一段碱基顺序，能特异性地与调节基因产生的变构蛋 白结合，操纵酶合成的时机与速度。 4.结构基因（Structural gene）: 决定某一多肽的 DNA 模板，与酶有各自的对应关系，其中的遗传信息可转录为 mRNA， 再翻译为蛋白质。酶合成调节的类型：酶合成调节的类型： 1.诱导

9、(induction) 组成酶：细胞固有的酶类。 诱导酶：是细胞为适应外来底物或其结构类似物而临时合成的一类酶。 2.阻遏 (repression) 分解代谢物阻遏(catabolite repression)反馈阻遏(feedback repression)酶生物合成的反馈阻碍作用：酶生物合成的反馈阻碍作用： 由某代谢途径末端产物的过量累积引起的阻遏。 实验： （1）大肠杆菌生长在无机盐和葡萄糖的培养基上时， 检测到细胞内有色氨酸合成酶的存 在； （2）在上述培养基中加入色氨酸，检测发现细胞内色氨酸合成酶的活性降低，直至消失。（3）表明色氨酸的存在阻止了色氨酸合成酶的合成，体现了菌体生长的经

10、济原则:不需要 就不合成。分解代谢物阻碍作用：分解代谢物阻碍作用： 指细胞内同时有两种分解底物（碳源或氮源）存在时，利用快的那种分解底物会阻遏 利用慢的底物的有关酶合成的现象。 分解代谢物的阻遏作用，并非由于快速利用的甲碳源本身直接作用的结果，而是通过 甲碳源（或氮源等）在其分解过程中所产生的中间代谢物所引起的阻遏作用。实验：细菌在含有葡萄糖和乳糖的培养基上生长，优先利用葡萄糖。待葡萄糖耗尽后 才开始利用乳糖，产生了两个对数生长期中间隔开一个生长延滞期的“二次生长现象”这一现象又称葡萄糖效应，产生的原因是由于葡萄糖降解物阻遏了分解乳糖酶系的合 成。此调节基因的产物是环腺苷酸受体蛋白（CRP）,

11、亦称降解物基因活化蛋白（CAP） 。酶生物合成的模式：酶生物合成的模式：根据酶的合成与细胞生长之间的关系，可将酶的生物合成分为 3 种模式，即： 1.生长偶联型： a.同步合成型 酶的生物合成与细胞生长同步。 酶的合成可以诱导，但不受分解代谢物阻遏和反应产物阻遏。当去除诱导物、细胞进 入平衡期后，酶的合成立即停止，表明这类酶所对应的 mRNA 很不稳定。 b.中期合成型 酶的合成在细胞生长一段时间后才开始，而在细胞生长进入平衡期以后，酶的合成也 随着停止。 酶的合成受产物的反馈阻遏或分解代谢物阻遏。 所对应的 mRNA 是不稳定的。 2.部分生长偶联型：延续合成型酶的合成在细胞的生长阶段开始，

12、在细胞生长进入平衡期后，酶还可以延续合成较长 一段时间。 可受诱导，一般不受分解代谢物和产物阻遏。所对应的 mRNA 相当稳定。 3.非生长偶联型：滞后合成型 只有当细胞生长进入平衡期以后，酶才开始合成并大量积累。许多水解酶的生物合成 都属于这一类型。 受分解代谢物的阻遏作用。所对应的 mRNA 稳定性高。米氏方程米氏方程( (酶促反应动力学的推导及其原理酶促反应动力学的推导及其原理) )：影响酶促反应速度的因素影响酶促反应速度的因素 温度、pH、激活剂、抑制剂、底物浓度、酶浓度，等。可逆抑制（底物浓度对抑制程度的影响）：可逆抑制（底物浓度对抑制程度的影响）： 不可逆抑制：抑制剂与酶分子中的必

13、需基团以共价键结合，引起酶活性丧失，用透析 10-1kkk01100011000001010010100ESESEPSESEESSESESESt EESSESESES0SE , EES , SESSESES SESSEkdkkkd kkkkk kk kk kVk ? 10 m 1mmS S1/ SkkKkVV KK 或等物理方法不能除去抑制剂，因而不能使酶复活。 可逆抑制：抑制剂与酶分子必需基团以非共价键结合，引起酶活力降低或丧失，用透 析等物理方法能除去抑制剂而使酶活力恢复。 竞争性抑制作用 反竞争性抑制作用 非竞争性抑制作用 混合型抑制作用分离纯化的原理及其方法分离纯化的原理及其方法: :

14、 原理： 1、根据溶解度的不同：盐析法、有机溶剂沉淀法、共沉淀法、选择性沉淀法。 2、根据分子大小的差别：胶过滤（层析）法、超过滤法、超离心法。 3、根据电学、解离性质：吸附（层析）法、离子交换层析法、电泳法、聚焦层析法。 4、基于酶和底物、辅酶因子以及抑制剂间具有专一的亲和作用特点：亲和层析。 5、利用稳定性差异：选择性热变性法，酸碱变性法，表面变性法。 方法： 1、沉淀分离（溶解度差异） a.盐析沉淀法： log S=- KI（S-蛋白质溶解度；-水中溶解度；K-盐析常熟；I-离子强度） b.等电点沉淀法 c.有机溶剂沉淀法 温度：0下操作。 pH = pI。 离子和离子强度：中性盐通常能

15、增大蛋白质的溶解度，并能减少变性影响。多价阳离子效应：pH 略高于 pI，使之带负电荷，添加少量多价阳离子，与负电蛋白络 合。 有机溶剂：丙酮分离效果最好，引起失效也较少。 d.复合沉淀法 e.选择性变性沉淀法,等。 2、离心分离、过滤与膜分离（分子大小的差异） 3.层析分离极性相似的两分子间，其亲和力相近。层析技术，亦称色谱技术，是一种物理的分离方法。它是利用混合物中各组分的物理 化学性质的差别，使各组分以不同程度分布在两个相中，其中一个相为固定的(称为固定相)， 另一个相则流过此固定相(称为流动相)并使各组分以不同速度移动，从而达到分离。层析方法分离依据吸附层析利用吸附剂对不同物质的吸附力不同而使混合物中各组分分离分配层析利用各组分在两相中的分配系数不同，而使各组分分离离子交换层析利用离子交换剂上的可解离基团（活性基团）对各种离子的亲和力不同 而达到分离目的凝胶层析以各种多孔凝胶为固定相，利用流动相中所含各种组分的相对分子质量 不同而达到物质分离亲和层析利用生物分子与配基之间所具有的专一而又可逆的亲和力，使生物分子 分离纯化聚焦层析将酶