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1、 作者：武兆忠 刘敏 冯鉴强 林伟 邬恒夫 王金玉 李园【摘要】 目的 探讨 17雌二醇（E2）膜快速效应对人成骨样细 胞 MG63 的 OPG mRNA 快速表达水平影响。方法 采用 RTPCR 法分析经 E2 快速作用后的 MG63 细胞中 OPG mRNA 的表达水平。结果 E2 膜快速效 应能诱导人成骨细胞 MG63 OPG mRNA 表达水平出现一个快速增高现象， 其表达高峰时间为 E2 作用后的 10 min 左右，而且这一现象能被 G 蛋白 藕联抑制苏拉明所抑制。结论 而 E2 诱导的人成骨样细胞 MG63 中 OPG mRNA 表达水平的快速增高，可能与雌激素启动了雌激素膜受体
2、介导的 G 蛋白藕联受体调节的磷脂酶 C/腺苷酸环化酶通路有关。 【关键词】 膜快速效应；护骨素；雌激素；人成骨样细胞【Abstract】 Objective To explore 17estradiol (E2) membrane rapid effect on the expression of osteoprotegerin (OPG) mRNA in human osteoblastlike MG63.Methods The OPG mRNA expression in MG63 after rapid effect of E2 was detected by RTPCR. Resul
3、ts E2 membrane rapid effect induced the rapid expression of OPG mRNA in MG63, and the peak time was at 10 minutes after effect, which could be inhibited by suramin, a kind of the Gprotein inhibitor. Conclusions The rapid OPG mRNA expression in MG63 induced by E2 may be related with the phosphatidase
4、 C /adenylate cyclase passage through the membrane estrogen receptor mediated by estrogen.【Key words】 Membrane rapid effect; Osteoprotegerin (OPG); Estrogen; Human osteoblastlike cell雌激素调节骨代谢的作用机制目前还不完全清楚。经典的雌激素 效应是雌激素跨越细胞膜后与细胞内特异性受体结合所介导的基因效应。 近年来大量研究资料显示，雌激素除了经典的雌激素效应外，推测还存 在膜蛋白的雌激素非基因效应。目前国内外对雌激素
5、与膜蛋白结合后所 致的特异性效应的研究资料非常有限，仅有内分泌、血管和神经系统方 面的研究资料，如：性激素调节精子中的钙离子信号1、粒细胞 2、成骨细胞3、血管平滑肌细胞的离子通道4，5、海马神 经元6和成纤维细胞7等。17雌二醇（E2）的快速效应是通 过直接与膜蛋白结合而发生作用的，这些膜蛋白包括钙离子依赖性钾通 道蛋白、膜蛋白酶和受体等。而人成骨细胞是否也存在着细胞膜雌激素 受体(membranes estrogen receptor，mER)，以及雌激素膜快速效应是 否也参与人成骨细胞护骨素（OPG）表达目前还未见有相关的研究报道。 本研究选取人成骨样细胞株 MG63 进行实验，以验证成
6、骨细胞中是否存在细胞 mER，及其对雌激素经 mER 介导的 OPG 快速表达水平的影响。1 材料与方法 1.1 材料 人成骨样细胞株 MG63 购自美国培养保存中心（ATCC 号：CRL1427）。无酚红 MEM 购自 Hyclone 公司；特级胎牛血清 （FBS）为天津 TBD 灏洋生物产品；HistostainSP Kit 为 TD Science 公司产品；苏拉明和 E2 为 sigma 公司产品；总 RNA 提取试剂 盒为上海生工产品；一步法 RTPCR mRNA Selective PCR Kit Ver.1.1 试剂盒为 TaKaRa 公司产品；硫酸铵、硫酸镍、醋酸、 Tris、
7、DAB、H2O2 为国产分析纯产品。1.2 方法1.2.1 细胞培养 37水浴中快速复苏冷存的人成骨样细胞株 MG63，缓慢加入 35 ml 无酚红的内含 10%FBS 的 MEM 培养液的 25 cm25 cm 培养瓶中，第 2 天换液 1 次以除去已经死去而未贴壁的细胞。 以后每 2 d 换液 1 次，于 37、5%CO2 条件下培养。待细胞生长融合达 90%95%后，用 0.25%的胰蛋白酶消化传代。1.2.2 药物干预 胰酶消化收集细胞，以 105 细胞数平铺细胞于 25 cm25 cm 培养瓶中，加含 10%FBS 的无酚红 MEM 培养液，37、 5%CO2 条件下培养，第 2 天
8、换液 1 次以除去已经死去而未贴壁的细胞。 以后每 2 d 换液 1 次，于 37、5%CO2 条件下培养，待细胞生长融合达 90%95%后进行药物实验。干预前的细胞准备：一组细胞为 E2 干预组，在 E2 干预前用含 0.1%牛血清白蛋白的无酚红 MEM 培养液培养 6 h，然后改用含 10- 7mol/L E2 的 0.1%牛血清白蛋白的无酚红 MEM 培养液进行药物干预； 另一组为 E2+G 蛋白藕联抑制剂苏拉明（300 mol/L）干预组，在 E2 干预前用含有终浓度为 300 mol 苏拉明的 0.1%牛血清白蛋白的无酚 红 MEM 培养液培养 6 h，然后改用含 10-7mol/L
9、 E2 的 0.1%牛血清 白蛋白的无酚红 MEM 培养液进行药物干预。E2 干预：细胞在干预前用 PBS 洗涤细胞 3 次，然后用含终浓度 10- 7mol/L E2 的 0.1%牛血清白蛋白的无酚红 MEM 培养液，在 5%CO2、37条件下培养，并准确记录培养时间，分别于干扰后的 0、5、10、30 min、1 h 和 4 h 用预冷的 PBS 快速洗涤细胞 3 次， 0.25%的胰蛋白酶消化收集细胞。两组实验每个时间点实验均重复 3 次。1.3 RTPCR 测 OPG mRNA 的表达水平1.3.1 引物设计与合成 登陆 GenBank 网站查找并下载人 OPG（NM_002546）和
10、肌动蛋白（actin）的 cDNA 序列。选择设计优化条件后 primer5 软件设计引物。 OPG 上游引物： 5TTGCCCTGACCACTAC3，下游引物：5TTTGAGAAGAACCCATC3，扩 增产物长度为 264 bp。用 actin 基因作为内对照，上游引物： 5GACTACCTCATGAAGATCCT3，下游引物： 5GCGGATGTCCACCTCACACT3，扩增产物长度 313 bp。引物由北京赛 北盛生物技术公司合成。1.3.2 RTPCR 采用 Trizol 抽提经 E2 不同时间干预过的 MG63 细胞的总 RNA，紫外可见光光度计测总 RNA 浓度，A260/A2
11、80 的 OD 值，计算 其浓度与纯度，取 3 l RNA 电泳，以判断 RNA 有无降解。 一 步法扩增目的片段逆转录反应和 cDNA 扩增在同一反应管中进行，反应 体系为：于洁净工作台内冰上鸡尾酒法制作预备液，分管后最后加入样 本 RNA，每份成分如下：2RNA PCR 缓冲液 200 l、25 mmol/L MgCl2 80 l、10 mmol/L dNTP 40 l 和去核酶水 36 l。混匀后， 在每个无 RNAase 的 0.2 ml 的 PCR 管中加入 16.8 l 上述混合液，并 再加入下列各成份：40 U/l RNase 抑制剂、5U/l AMVOptimized Taq、
12、5 U/l AMV RTase XL、上下游引物各 0.4 l 和总 RNA 0.4 g。总反应体积为 20 l。50 30 min 进行逆转录反应，85变性 1 min，进入扩增。扩增条件为：85变性 1 min，45退火 1 min，72延伸 1 min，38 个循环后 72再延伸 7 min。扩增产物经 1.5%的琼脂糖凝胶电泳，EB 染色，凝胶成像分析系统（UV1 photo MV）分析图像。1.4 统计学分析 采用 SPSS11.0 统计软件。不同时间 E2 和 E2+ 苏拉明作用 MG63 细胞后 OPG mRNA 表达水平间的资料比较用单因素 ANOVA 最小显著性差异法（LSD）进行分析。
