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1、鞘内注射丙戊茶碱对神经痛大鼠脊髓背角星形胶质细胞的影响鞘内注射丙戊茶碱对神经痛大鼠脊髓背角星形胶质细胞的影响卜晓萱 李琼 沈志忠(苏州大学附属第三人民医院 江苏 常州 213003)摘要摘要 目的目的 观察鞘内注射丙戊茶碱(PPT)对慢性坐骨神经挤压损伤（CCI）大鼠脊髓背角星形胶质细胞(AST)的影响。 方法方法 雄性 SD 大鼠 24 只，随机分为三组（n =8）：假手术组（A 组） ；CCI 组（B 组） ；丙戊茶碱组（C 组） 。C 组于术后3、5、7、9、11、13 天鞘内注射丙戊茶碱 10g/rat，A、B 组注射等量的生理盐水。用热辐射抬足法测定痛阈，用免疫组织化学方法测定脊髓背
2、角 AST 的 GFAP 活性。 结果结果 与 A 组相比，B、C 组术后第 8 和 14 天术侧热痛阈值下降，且 GFAP 的免疫反应阳性产物增多（p0.05） ；与 B 组相比，C 组术后第 8 和 14 天术侧热痛阈值升高，GFAP 的免疫反应阳性产物明显降低（p0.05） 。 结论结论 慢性神经痛的机制可能涉及脊髓 AST的激活，丙戊茶碱通过抑制 AST 的激活而具有镇痛作用。关键词关键词 丙戊茶碱； 神经痛； 星形胶质细胞Effect of intrathecal propentofylline on the astrocyte in the spinal dorsal root i
3、n the rats of chronic neuropathic pain Bu Xiaoxuan , Li Qiong, Shen Zhizhong. Department of Anesthesiology, Affiliated Third Hospital, Suzhou University, Changzhou 213003 CHINAAbstract Objective To investigate the effect of intrathecal propentofylline on the astrocyte in the spinal dorsal root in th
4、e rats of chronic neuropathic pain produced by chronic constrictive injury(CCI). Methods Twenty-four male SD rats randomly divided into 3 groups(n=8):A sham-operated group; B CCI group and C PPT group. C group was intrathecal PPT by passing a PE-10 catheter which was inserted into L4-5 spinal subara
5、chnoid space at days 3、5、7、9、11 and 13 postsurgery. In group A and B normal saline was given intrathecally instead of PPT. The pain threshold was measured using the conventoined paw withdrawal test. The changes of the spinal astrocytes response was examined by immunohistochemistry of glial fibrillar
6、y acidic protein (GFAP) . Results In group B、C pain threshold to heat noxious stimulation decreased as compared to shame-operated group(A), and the spinal astrocytic activity was significantly elevated(p0.05). To compare with B, the pain threshold of C group increased as measured by behavioral test
7、and the elevate in spinal GFAP immunostaining was also greatly blocked(p0.05). Conclusion The activity of the ASTs in spinal cord may be involved in the mechanism of chronic neuropathic pain. Propentofylline may prevent and treat the chronic neuropathic pain by inhibiting the activity of AST. Key wo
8、rd Propentofylline neuropathic pain astrocyte外周神经损伤后常诱发神经源性疼痛，疼痛的治疗受到极大的关注。以往人们对疼痛和疼痛调节的研究主要着眼于神经元，而中枢神经系统中的胶质细胞一直未引起关注。而近年来脊髓胶质细胞作为中枢神经系统中的免疫细胞逐渐成为疼痛研究的新亮点。本文用免疫组织化学方法研究慢性病理性疼痛中脊髓 AST 的变化，从而为阐明慢性病理性疼痛的机制与 AST 的关系提供实验依据。材料与方法材料与方法药品与试剂药品与试剂 丙戊茶碱（SIGMA 公司） ，抗胶质纤维酸性蛋白（GFAP）试剂盒（北京中山公司） 。动物及分组动物及分组 S-D
9、大鼠 24 只，雄性，体重 200-280g，随机分为 3 组（n=8） 。A组：假手术组，仅在空气中暴露坐骨神经 5min,不结扎；B 组：CCI 组；C 组：丙戊茶碱组。CCICCI 模型的建立模型的建立 根据 Bennett-Xie1的方法建立 CCI 模型，大鼠麻醉后暴露坐骨神经，在显微镜下用 4 根 3-0 含铬羊肠线，在近坐骨神经三叉分支上 4-5mm 处轻轻结扎坐骨神经，每根羊肠线相距 0.5mm ,要求只留下缢痕而不阻断神经血供，逐层缝合伤口。鞘内给药鞘内给药 根据杨建平2的方法，经大鼠 L4-5 间隙穿刺向蛛网膜下腔置入 PE-10 导管，C 组在 CCI 模型建立后 3、5
10、、7、9、11、13 天经导管鞘内注射丙戊茶碱10g/rat，A 组和 B 组注射等量的生理盐水。痛阈测定痛阈测定 令大鼠自由站立于玻璃罩内铁丝网架上，用 50W 卤素灯作为热辐射光源，置于铁丝网架下，距离 3 cm，照射大鼠足底无毛区。测定其逃避反应（抬足）出现的潜伏期，以 20s 为其最长照射时间的上限，每次间隔 5min,至少测定 4 次，直至连续 3 次的测定值相近，以该 3 次的均值作为热痛阈值。组织制备及免疫组织化学染色组织制备及免疫组织化学染色 在术后第 14 天将动物深麻醉，快速开胸插管至升主动脉，先用 0.9%生理盐水快速灌注，再迅速改用 4%多聚甲醛溶液灌注固定。取腰骶段
11、L4-5 脊髓，在上述多聚甲醛溶液中固定 4-6h，然后移入 30%蔗糖溶液中4冰箱过夜。冰冻连续横切片，片厚 20m，按 GFAP 试剂盒说明书行免疫组织化学染色。根据 GFAP-免疫阳性细胞体的变化程度将反应分为阴性、弱阳性和强阳性。统计分析统计分析 痛阈测定结果以均数标准差（xs）表示，用 SPSS10.0 软件包，行单因素方差分析，p0.05 为差异有显著性。GFAP 免疫组化染色结果，采用卡方检验，p0.05 为差异有显著性。结结 果果与 A 组相比，B、C 组术后第 8 和 14 天术侧热痛阈值均下降（p0.05）,与 B 组相比，C 组术后第 8 和 14 天术侧热痛阈值升高(p
12、0.05)。(见下表)表 术后不同时相热痛阈变化值（xs） （单位：s）组 别术 前术后 8d术后 14dA 组（假手术组）16.362.7315.693.1516.052.64B 组（C C I 组） 16.983.279.72.67*7.852.11*C 组（P P T 组）15.933.6212.562.34*#11.232.18*#与假手术组相比，*P0.05；与 CCI 组比，#P0.05GFAP 染色结果显示，在 CCI 大鼠的脊髓切片中，坐骨神经结扎侧的 AST 与对侧相比明显被激活（图 1） 。 A 组大鼠脊髓中仅有少量星型胶质细胞细小突起着色，GFAP 免疫反应呈阴性；B 组
13、 GFAP 的免疫反应阳性产物明显增多，表现为 GFAP免疫阳性细胞胞体粗大，突起增多、变粗，呈强阳性，与 A 组和 C 组相比差异均有显著性（p0.05） ；C 组鞘内给予丙戊茶碱可抑制 AST 的激活，GFAP 的这一升高即被明显抑制，呈弱阳性，细胞突起稍增粗，免疫反应程度介于 A 组和 B 组之间（p0.05） 。 （见图 2-4）图 1 100 图 2 假手术组 400 图 3 CCI 组 400 图 4 PPT 组 400讨讨 论论本实验显示，AST 的形态在 CCI 大鼠的患侧发生了显著的变化，用胶质细胞调节剂抑制 AST 的激活能够有效抑制痛觉过敏的产生，这一结果与国外学者发现胶
14、质细胞在病理性痛的发生和维持中，发挥着重要的作用3相一致。GFAP 是一种 AST 特异性标记蛋白，GFAP 的表达水平通常反映了 AST 的生物活性。在本实验中大鼠脊髓背角 AST 受到慢性坐骨神经挤压损伤刺激后表现出激活状态，其特征是 GFAP 免疫阳性细胞体积增大、突起增多、特异性 AST 中间微丝蛋白免疫性增强3。黄嘌呤衍生物丙戊茶碱是一种胶质细胞调节剂，不仅能抑制 AST的激活，消除细胞肿胀，拮抗其活性物质释放及其活性作用，还能抑制炎症因子、氧自由基和 NO 的释放。胶质细胞参与痛觉过敏的机制尚不了解。AST 作为胶质细胞一员，其细胞膜上存在着许多离子通道、神经递质的受体，能够产生和
15、释放神经活性物质，在慢性病理性疼痛的形成过程中起着重要的作用4。慢性病理性疼痛的产生与胶质细胞的激活和其激活后释放的炎症因子的致痛作用是分不开的。近年来大量的实验证据表明，胶质细胞不再是神经系统中的一个静止不动的成分，而是处于一个与神经元不断进行信息交流的动态过程。在病理性痛刺激下，被激活的胶质细胞释放的物质中大部分是痛敏的关键调节物，如花生四烯酸，白三烯，NO 等，它们作用于脊髓背角的痛觉传递神经元使其处于敏化状态。被激活的胶质细胞还能释放前炎症细胞因子，如白细胞介素 1(IL-1)，白细胞介素 6(IL-6)和肿瘤坏死因子(TNF)等，它们作用于突触前膜增强伤害性神经递质 SP，EAAs
16、的进一步释放5、6。另外 AST 是脑内兴奋性神经递质 Glu 代谢的重要场所，AST 具有很强的 Glu 摄取能力，并含有谷氨酰胺合成酶，能将 Glu 转变成谷氨酰胺，再转运到神经末梢，经谷氨酰胺酶脱氨生成 Glu。释放入突触间隙的 Glu，绝大部分经神经元重摄取而被回收再利用，一部分被 AST 所摄取。后者的意义在于防止过量的 Glu 扩散到周围的神经元上，以免引起神经系统的过度兴奋，甚至受损和变性。可见 AST 在中枢敏化和脊髓传导转化方面具有关键性作用。综上所述，慢性神经痛的机制可能涉及脊髓 AST 的激活，丙戊茶碱通过抑制AST 的激活而具有镇痛作用，但其具体机制还有待于进一步研究。参参 考考 文文 献献1. Bennett GJ,
