《波尔山羊精子体外获能及体外受精的研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《波尔山羊精子体外获能及体外受精的研究（39页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、四川农业大学硕士学位论文波尔山羊精子体外获能及体外受精的研究姓名：梁鑫申请学位级别：硕士专业：动物遗传育种与繁殖指导教师：马恒东20040501摘要本试验就国内近些年来引进的波尔山羊进行了精子体外获能和体外受精的研究，利用去透明带仓鼠卵穿透试验和台盼蓝姬姆萨双重顶体染色( T G ) 技术检测了精子的死活和获能效果，同时将获能的精子与体外培养成熟的屠宰山羊卵母细胞和超排山羊卵母细胞进行了体外受精试验。在获能液中孵育2 3 h 后，部分精子呈超激活运动方式，表现为激烈的穿梭运动和“鞭打样”运动。由此可以初步确认精子开始或已经获能。精子用离心法和上游法处理后的顶体反应率和活力表明，上游法更有利于波
2、尔山羊精子的处理。洗涤后的精子放入含有2 0 p g m l 肝素的T 液( 含6 m g m lB S A + 1 0 m m o l LH E P E S ) 、B 液( 含2 m g m lB S A + 5 m m o l LH E P E S ) 、D 液( 无B S A和H E P E S ) 三种培养液中进行获能处理，结果表明T 液处理波尔山羊精子的效果明显优于B 液和D 液，精子孵育4 6 h 的顶体反应率T 组极显著高于D 、B 组( P 0 0 5 ) 。无论是从顶体反应率还是从穿透率上看，肝素的添加剂量以2 0 9 m l 和5 0 j m l的效果较好，与2 0 吲m
3、l 以下肝素组的效果相比差异极显著( P 0 0 5 ) 。钙离子载体的添加剂量以O 3 1 t m o l L 为宜，顶体反应率和去透明带仓鼠穿透率均高于其它剂量组。咖啡因与肝素、钙离子载体具有协同作用，尤其与钙离子载体的协同作用更加明显，去透明带仓鼠卵穿透率达到7 8 3 。无论是肝素还是钙离子载体，获能精子与去透明带仓鼠卵孵育4 h 和6 h 的穿透率均高于2 h 时的穿透率。经肝素诱导的获能精子与山羊成熟卵母细胞进行体外受精的适宜时间为1 7 h ，时问短时精卵未完全结合，时间长则对受精卵的进一步发育不利。超排山羊卵母细胞的受精率略高于体外培养成熟的屠宰山羊卵母细胞。山羊的冻精比较脆弱
4、，获能后活力急剧下降。从顶体反应率来看，鲜精的获能效果明显优于冻精，二者差异极显著( P 00 5 ) 。当培养到4 h 6 h 后I ：游法明显优于离心法，二者差异极届著( P 00 5 ) ，母小l 州表H 差异U 持( P 0 0 5 ) 。伯o捧v碍越岖蛞肾21幽02 h ，T 组效果显著高于B 、D 组，二者差异显著( P 0 0 5 ) 。4 h 和6 h 时，T 组和D 、B 组相比差异极显著( P O 0 5 ) ，人q 一母川、0 + t 母缄人 ，母小川省表表_ 董异极! I l l 著( ， O0 5 ) 。获能l h 和2 h 相比，B 、D 培养液差异显著( P O
5、0 5 ) 人。弓j ，母小I 叫崭表水差异板诅省( F 0 0 5 ) 。其q ，1 0 p N m l 肝素组与未添加肝素剂量组相比差异不显著( P O 0 5 ) 。无论是获能效果还是活力，鲜精的效果均极显著高于冻精( P 0 0 5 ) ；l 加啡因与肝素协同作用可增强精子的穿透效果，穿透率达到7 0 O 。3 2 4 钙离子载体处理后精子对去透明带仓鼠卵穿透情况钙离子载体处理后精子对去透明带仓鼠卵穿透情况结果如表9 。表9 钙离子载体处理后精于的穿透率T a b l e9I m p a c t so fI Ao nt h eS P A从表中可以看出：钙离子载体能明显促进精子的获能，与
6、对照组穿透率相比差坞“挖如00000*v肆世嶙堆督异极显著( P O 0 5 ) 。由此可见，在该实验条件下，精子获能的最佳时间以4 h 为宜。这一结果与斛智莲( 2 0 0 2 ) 【8 】报道的结果相符，但与石其贤、陈大元等报道的羊精子体外获能时问为7 h 的结果不相符；与上述学者的报道也略有差异。其中原因可能与培养基的成分、获能处理的具体方法和程序及山羊品种等有关，有关这一问题有待于进一步研究。目前的研究表明，精子获能的时问并非一成不变，获能培养液的物理化学成分和动物的生理状态均会对此产生影响。可能主要与精子质膜的稳定性有关。Y a n a g i m a c h i ( 1 9 9 4
7、 ) 报道，保持精子质膜稳定的条件可延长获能时间，而破坏精子质膜稳定的条件则会缩短获能时间【8 引。考虑到精子活力在体外受精中的重要性，在不影响精子获能效果的情况下，获能时间应越短越好。4 2 不同诱导成分对精子体外获能的影响肝素作为一种有效的获能诱导剂在山羊的体外受精中取得良好的效果。它是一种生物活性较高的粘多糖，富含氨基硫酸基，是硫酸化程度最高的氨基葡聚糖( G A G s ) 。研究表明，G A G s 不仅在体内对精子获能和顶体反应起重要作用 4 7 】，而且能诱导牛附睾精子和射出精子的体外获能和顶体反应，肝紊的硫酸部分以硫酸酯形式存在，且可与氨基葡萄糖的氨基缩合，这就使肝素可与某些肽
8、的活性氨基和糖蛋白的活性氨基结合，改变其构型和生化特性，达到消除抑制并激活受体酶的目的。另有报道，加入肝素后，精子中C a 2 + 的浓度也会升高1 4 9 1 ，这川能是由于肝素激活了细胞本身的离子泵运输钙离子的酶，而不是自身有运输c a 2 + 的功能。肝素诱导的获能被认为是一种接近于体内获能的生理性方法【。1 1 1 7 3 州1 。P a r r i s ( 1 9 8 8 ) 认为，肝素在1 0 9 9 m l 浓度下，牛精子要经过4 h 的预培养力能获能较好【”1 。可能在低浓度肝素添加剂量下，需足够长的时间才能起到获能的效果，提高剂量可缩短获能时间。F i r s t 等报道，肝
9、素的作用与其剂量和处理时| 自J 有关，精子的获能和A R 随肝素浓度增高，效果加强，并符合正念分前i 【47 1 。张嘉保在羊精子体外获能的试验结果也符合F i r s t 描述的难态分布，且发现肝索还能促进原核的发育【2 4 】。本试验与前人的研究结果基本一致。但就统计学角度讲，肝素浓度在1 0 2 9 m L 时，与不加肝素组差异不显著( p 0 0 5 ) ，至少在4 h 内不能有效的促进精子获能。在2 0 9 9 m L 和5 0 9 9 m L 时，其效果极显著高于未添加组和1 0 9 9 m L 肝素组( p 0 0 5 ) T h ed o s a g eo f l Ai ss
10、 u i t a b l eo nO 3 1 a m o l L A f t e ra d d i t i o no fc a p a c i t e ds p e r m st r e a t e dw i t hh e p a f i no rI At ot h eh a m s t e re g g s ，P e n e t r a t i o nr a t eo f s p e r m si n c u b a t e df o r4 - 6 hw a ss i g n i f i c a n t l yh i g h e rt h a nt h a tf o r2 h P e n e
11、 t r a t i o nr a t eo fg o a ts p e r m st r e a t e dw i t h2 0 1 a g m lh e p a r i no r0 3 9 m o l LI Aw a s6 4 7 o r6 8 2 r e s p e c t i v e l y C a f f e i n eh a das y n e r g e t i ce f f e c ti nc o m b i n a t i o nw i t hh e p a r i no rI Ao ne n h a n c e m e n to f p e n e t r a t i o
12、nr a t eT h eh i g h e rf e r t i l i z a t i o nr a t ew a so b t a i n e dw h e no o c y t e sa n ds p e r mc e l l sw e r ei n c u b a t e df o r1 7 ht h a n8 h ( P 0 0 1 ) T h ef e r t i l i z a t i o nr a t eo fI V Mo o c y t e sw a s6 0 0 a n df e r t i l i z a t i o nr a t eo fo o c y t e sa
13、f t e rs u p e r o v u l a t i o nW a S6 5 。0 t h el a t t e rw a sl i t t l eh i g h e r B e c a u s eo fr e l a t i v ef r a g i l i t yo fg o a ts p e r m sa f t e rf r e e z e - t h a w i n g ，I t sv i a b i l i t yr a p i d l yd e c r e a s e da f t e rt r e a t m e n to fi nv i t r oc a p a c
14、i t a t i o n A c r o s o m er e a c t i o nr a t ei n d i c a t e df k s hs p e r mw a ss i g n i f i c a n t l yh i g h e rt h a nf r e e z e t h a w i n gs p e r m ( P 0 0 1 ) K e yw o r d s ：B o e rg o a t ：s p e r m a t o z o a ：p e n e t r a t i o nr a t e ；a c r o s m er e a c y i o nr a t eI
15、 nv i t r of e r t i l i z a t i o n3 5附录l阁版及说明1 到1 项体反应活精子( 2 0 0 )| 冬J2 顶体反府死精子( 2 0 0 )I 划3 无项体反应活精f ( 2 0 0 )图4 无项体反廊死精于( 2 0 0 )图6 发情期仓鼠阴道涂片( 2 0 0 )幽7 被精于包m 的仓鼠卵( 2 0 0 X )圈8 糟r 粘附r 仓鼠卵表面( 4 0 0 )9 排旃一极体仓鼠卵( 2 0 0 )1 0 l F f L 穿越仓鼠卵透u 】带( 2 0 0 )州1 2 柑J 穿人仓鼠卵( 4 0 0 X )图1 3 精子穿入羊卵透明带( 4 0 0 X )幽1 4 排山第二极体卵( 2 0 0 )k - - “ qI5 朱见第二极体的退化卵( 2 0 0 X )幽1 6 朱受精的退化卵( 2 0 0 X )H1 7 凋亡i E ! 化的受精卵( 2 0 0 )
