口腔生物学课件_5口腔细胞培养及其应用

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1、口腔细胞培养及其应用 细胞培养：模拟体内的生理环境，在适当的条件下，使活体组织细胞在体外环境存活、生长增殖，并维持其结构功能。 贴壁型细胞： 必须贴附于支持物表面才能生长。大多数培养细胞贴附生长，属于贴壁依赖性细胞 潜伏期（游离期，贴壁期） 对数生长期 停止期（平台期） 潜伏期：细胞接种培养后，先经过一个在培养液中呈悬浮状态的悬浮期。此时细胞胞质回缩，胞体呈圆球形。接着是细胞附着或贴附于底物表面上，称贴壁，悬浮期结束。各种细胞贴附速度不同，这与细胞的种类、培养基成分和底物的理化性质等密切相关。 初代培养细胞贴附慢，可长达 1024 小时或更多；连续细胞系和恶性细胞系快，1030分钟即可贴附。细

2、胞贴附现象是一个非常复杂和与多种因素相关的过程。支持物能影响细胞的贴附；底物表面不洁不利贴附，底物表面带有阳性电荷利于贴附。另外在贴附过程中，有一些特殊物质如纤维连接素，细胞表面蛋白等也参与贴附过程。这些物质都是蛋白类成分，它们有的存在于细胞膜的表面，有的则来自培养基中的血清。贴附是贴附类细胞生长增殖条件之一。超净台 滤 器 压力蒸汽消毒器：湿热消毒，用途广 电热干燥箱：干热消毒（160 ，2 小时） 。主要用干玻璃 器皿消毒 滤器：过滤除菌：大多数培养用液，如人工合成培养基、血清、 酶液等均采用滤过法除菌 超净工作台：为细胞操作提供无菌环境 紫外灯 ：紫外线消毒。 主要用于培养室空气、操作台

3、、塑料 培养皿和培养板等表面消毒 水：新鲜配置的三蒸水或去离子水 平衡盐溶液：无 Ca2+、Mg2+的缓冲液 天然培养基： 天然培养基有血清、血浆、和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液） 。 优点：营养成分丰富，培养效果好 缺点：来源受限。 成分复杂，影响对某些实验产物的提取和实验结 果的分析。 易发生支原体污染 合成培养基 合成培养基是根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成的。目前已设计出许多种培养基，如 TC199、MEM、RPMI-1640、 DMEM 等。 合成培养基主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和其它一些辅助物质。 优点：标准化生产，组分和含量相对固定。 成本低

4、 缺点： 缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生长需要。 人工合成培养基只能维持细胞生存，要想使细胞生长和繁殖，还需补充一定量的天然培养基（如血清） 。 血清中含有： 多种蛋白质（白蛋白、球蛋白、铁蛋白等） 多种金属离子； 激素； 促贴附物质，如纤粘蛋白、冷析球蛋白、胶原等。 各种生长因子 转移蛋白 不明成分 无血清培养基的主要研制策略：在基础培养基中补充各种必需因子，如激素、生长因子 、结合蛋白 、贴壁和扩展因子 等。 无血清培养基由基础培养基和替代血清的补充成分组成。 无血清细胞培养基的使用保证了实验结果的准确性、可重复性和稳定性， ，减少了细胞污染，简化了提纯和鉴定各种细胞产物的程序。 低

5、温保护剂的应用 在细胞冻存时加入温保护剂，能大大提高冻存效果。 常用的低温保护剂是 DMSO，它是一种渗透性保护剂，可迅速透入细胞，提高胞膜对水的通透性，降低冰点，延缓冻结过程，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，在胞外形成冰晶，减少胞内冰晶，从而减少冰晶对细胞的损伤。 冻存和复苏的原则：慢冻快融当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶。 如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶；相反结晶就大，大结晶会造成细胞膜、纲胞器的损伤和破裂。复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶。 原代培养 取自体内新鲜组织并置于体

6、外条件下生长的细胞在传代之前称为原代培养。 传代培养 细胞在培养器皿中生长一定时间后，被分开接种到新的培养器皿中。 功能特点 分泌功能 矿化功能 收缩功能 附着能力 再生能力 增殖分化影响因素 生长因子 胰岛素 纤维粘连蛋白 抗坏血酸 羟基磷灰石 二、唾液腺细胞 细胞形态特点 腺泡上皮细胞 导管上皮细胞 肌上皮细胞 免疫组织化学染色 腺泡上皮细胞：角蛋白、淀粉酶、对氨基水杨酸、导管上皮膜、 前角蛋白、单克隆角蛋白、分泌成分阳性反应 导管上皮细胞：角蛋白、上皮膜蛋白、磷酸酐酶抗体染色阳性反应 肌上皮细胞： 肌动蛋白、S100 蛋白、肌凝蛋白抗体染色阳性反应 功能特点 分泌功能 腺泡细胞：淀粉酶、

7、PRP、唾液过氧化物酶、特异蛋白等 腺泡上皮细胞：顶端分泌、基底及侧膜分泌 导管细胞：胶原 肌上皮细胞：胶原 唾液腺细胞的增殖分化 基底潜能干细胞理论 单细胞全能干细胞理论 双细胞亚全能干细胞理论 增殖分化功能影响因素 细胞因子 激素 细胞外基质 钙离子 三、口腔粘膜细胞 培养方法 组织块法 酶消化法 细胞形态特点 免疫组织化学染色 波形丝蛋白表达阴性 多种角蛋白表达阳性 功能 分泌：胶原蛋白和非胶原蛋白 金属蛋白酶 四、颌骨相关的硬组织细胞 分散组织 机械分离法 消化分离法 培养细胞的纯化 人工纯化（酶消化法，机械刮除法，反复 贴壁法，克隆法等） 自然纯化 细胞的冻存与复苏 所谓冷冻保存，就

8、是将体外培养物或生物活性材料悬浮在加有或不加冷冻保护剂的溶液中，以一定的冷冻速率降至零下某一温度，并在此温度下对其长期保存的过程。而复苏就是以一定的复温速率将冻存的体外培养物或生物活性材料恢复到常温的过程。不论是微生物、动物细胞、植物细胞还是体外培养的器官都可以进行冻存，并在适当条件下复苏。 常规细胞培养法 细胞培养的污染、检测与控制 微生物污染 空气、器材、操作、试剂、组织标本 微生物污染的检测 细菌和真菌的污染和检测 肉眼直接观察法 培养检查法 显微镜观察法 支原体的污染和检测 造成支原体高污染率的原因： 0.8 um，无细胞壁，可透过一般过滤膜（0.22-0.45 um） ； 2.支原体

9、污染时，没有明显的肉眼或一般光学显微镜可观察到的特征变化 ；3.过去缺乏简单、快速且可靠的检测方式； 4.细胞流通间缺乏物品管理，造成实验室间的相互污染； 5.研究或操作人员忽略污染问题； 6.已受污染的细胞； 7.已受污染的培养基、血清。 支原体之检测：相差显微镜观察法、电镜法 Hayflick 培养基直接培养法 DNA 荧光染色法 PCR 方法 微生物污染的控制 抗生素除菌法 加温处理 化学污染 细胞交叉污染 第二节 口腔医学中相关细胞培养及其特点 一、 牙齿相关细胞 牙髓细胞 培养中的细胞成分： 成纤维细胞 未分化的间充质细胞 培养方法 取材 浸泡 修剪 铺瓶 培养 细胞形态特点 免疫组

10、织化学染色 波形丝蛋白表达阳性 角蛋白、神经丝蛋白、结蛋白、胶质细胞 原纤维酸性蛋白表达阴性 生长增殖特点 成功率 快速增殖期 死亡 功能特点 碱性磷酸酶活性 矿化现象 对钙调节因子的作用 对细胞因子的反应 对氢氧化钙、羟基磷灰石盖髓剂的反应 牙周膜细胞 培养方法 取材 浸泡 修剪 铺瓶 培养 培养中的细胞成分： 成纤维细胞 未分化的间充质细胞 细胞形态特点 免疫组织化学染色 波形丝蛋白表达阳性 角蛋白、神经丝蛋白、结蛋白、胶质细胞 原纤维酸性蛋白表达阴性 生长增殖特点 成功率 快速增殖期 死亡 指数增生期：这是细胞增值最旺盛的阶段，细胞分裂相增多。指数增生期细胞分裂相数量可作为判定细胞生长旺

11、盛与否的一个重要标志。一般以细胞分裂指数表示，即细胞群中每 1000 个细胞中的分裂相数。一般细胞的分裂指数介于 0.1%0.5%，初代细胞分裂指数低，连续细胞和肿瘤细胞分裂指数可高达 3%5%。 特点： 是细胞增生最活跃、活力最旺盛的阶段 培养物中细胞数量呈指数增长,细胞群体均一 是理想的实验用细胞在接种细胞数量适宜情况下，指数增生期持续 35 天后，随细胞数量不断增多、生长空间渐趋减少、最后细胞相互接触汇合成片。细胞相互接触后，如培养的是正常细胞，由于细胞的相互接触能抑制细胞的运动，这种现象称接触抑制。 细胞接触汇合成片后，虽发生接触抑制，只要营养充分，细胞仍然能够进行增殖分裂，因此细胞数

12、量仍在增多。但当细胞密度进一步增大，培养液中营养成分减少，代谢产物增多时，细胞因营养的枯竭和代谢物的影响，则发生密度抑制，导致细胞分裂停止。 停滞期：细胞数量达饱和密度后，细胞遂停止增殖，进入停滞期。此时细胞数量不再增加，故也称平台期。停滞期细胞虽不增殖，但仍有代谢活动，继而培养液中营养渐趋耗尽，代谢产物积累、pH 降低。此时需做分离培养即传代，否则细胞会中毒，发生形态改变，重则从底物脱落死亡，故传代应越早越好。 培养细胞的体外生长环境 无污染环境 超净工作台的工作原理是利用鼓风机驱动空气遁过高效滤器除去空气中的尘埃颗粒，使空气得到净化。净化空气徐徐通过工作台面，使工作台内构成无菌环境。 基

13、质 玻璃基质 塑料 饲养细胞 生物性基质处理培养表面 金属 气体环境和氢离子浓度 Hepers 缓冲液 CO2 +H2O H2CO3 H+ + HCO3- CO2: 5% 液相环境 温度 渗透压 二、细胞培养的基本方法 无菌操作技术 体外培养细胞缺乏抗感染能力，所以防止污染是决定培养成功或失败的首要条件。即便使用设备完善的实验室，若实验者粗心大意，技术操作不规范,也会导致污染。因而,为在一切操作中最大可能地保证无菌，每一项工作都必须做到有条不紊和完全可靠。 培养前准备 在开始实验前要制定好实验计划和操作程序。有关数据的计算要事先做好。根据实验要求，准备各种所需器材和物品放置操作场所(培养室、超

14、净台)内消毒。这可以避免开始实验后，因物品不全往返拿取而增加污染机会。培养室的消毒 无菌培养室每天都要用 0.2%的新洁尔灭拖洗地面次(拖布要专用)，紫外线照射消毒 30-50min，超净工作台台面每次实验前要用 75酒精擦洗。然后紫外线消毒 30min。些操作用具如移液器、废液缸、污物盒、试管架等用 75%酒精擦洗后置于台内同时紫外线消毒。洗手和着装 原则上和外科手术相同。并于开始操作前要用 75酒精消毒手和前臂。如果实验过程中手触及可能污染的物品和出入培养室都要重新用消毒液洗手。进入原代培养室需彻底洗手还要戴口罩、着消毒衣帽。 培养过程中的无菌操作 在无菌环境进行培养或做其它无菌工作时，首先要点燃酒精灯。以后一切操作，如按装吸管帽、打开或封闭瓶口等，都需在火焰近处并经过烧灼进行。 进行培养时，动作要准确敏捷，但又不必太快，以防空气流动，增加污染机会。不能用手触及已消毒器皿，如已接触，要用火焰烧灼消毒或取备品更换。 基本培养操作技术 培养细胞的取材与分离 取材部位准确 严格无菌操作 尽快培养 减小损伤 制备标本 * * 武汉大学口腔医学院