普鲁兰酶逆向合成麦芽糖基-α-甜环糊精

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1、F O O D A N D F E R M E N T A T I O N I N D U S T R I E S 普鲁兰酶逆向合成麦芽糖基- 环糊精 张永伟 ， 徐 学明，赵建伟 ，王金 鹏 ， 金征 宇 (江南大学 食品科学与技术国家重点实验室 ， 江苏 无锡 ， 2 1 4 1 2 2 ) 摘 要 以麦芽糖和 O t 一 环糊精作为底物 ， 利用普鲁兰酶逆向合成作 用合 成了麦芽糖基一 d 一 环糊精。用薄层色谱 、 液一 质联用对产 物进 行 了鉴定 ， 并用薄层色谱 对其分 离。对 影响麦芽糖基一 一 环糊精合 成 的反 应物摩尔 比( 麦 芽 糖 a 一 环糊精) 、 底物 浓度

2、、 反应温度 、 反应时 间、 加酶量 、 p H 等 因素分别做 了单 因素实验 ， 最终确定 了反应条件 ： 反应物摩尔比( 麦芽糖 o r 一 环糊精) 为 1 6： 1 ， 反应 时间 2 4 h ， 反 应温度为 5 8 ， 加 酶量 4 0 0 U g d 一 环糊精， p H 4 5 。 关键词 麦芽糖一 一 环糊精 ， 麦芽糖 ， d 一 环糊精 ， 普鲁 兰酶 环糊精在食品 、 医药化妆 品、 分析化学等领域被 广泛应用 。但 是 ， 母 体 环 糊精 一般 溶 解性 较 小 ， 具 有 一定毒性 ， 这 就大大 限制 了其应 用范 围 I 3 。分支 环 糊 精是环 糊精

3、的衍 生物 ， 在环糊 精分 子 的羟基上 连有 单糖或 多糖 的残基 ， 这样 可 以扩大母 体环糊 精 的亲水 性 ， 改善 其溶解 性 。近 些 年 ， 对 天然 环 糊 精 进行 糖 基的侧链修饰 的科研工作在 国外得到重视并取得进 展 ， 但 国 内才刚 刚起步 。 麦芽糖 基 一 o 【 一 环 糊 精 ( Ma l o L c y c y c l o d e x t r i n ) 是 仪 - 环糊 精在其 葡萄糖 残 基 的第 6位 碳 原子 的羟 基上 偶 联 1 个 麦 芽糖残 基 的 分支 环 糊 精 。其 在水 中溶 解度 为 4 3 g ( 1 0 0 m L ) ，

4、 且 无 任 何 毒性 与溶 血 性 ， 如果 能 实 现产业 化生产 ， 将 对 食 品 、 医药 等 行业 产 生 巨大影 响。麦芽 糖基 环糊 精 的合成 与应 用研 究 国外 有 过 报 道 - 6 ， N a o m i 等人 用麦 芽糖 基 - 一 环糊 精与 C a c o 一 2 细 胞建 立 模 型 ， 突 出 了 麦 芽 糖 基 一 环 糊 精 的 无 毒 性E 7 3 。F u k a y a等人用麦芽糖基一 一 环糊精包合一种治 疗 哮 喘 的 药 物 ， 包 合 后 药 物 利 用 率 是 原 来 的 数 十 倍 J ， 但 是 麦 芽 糖基 一 一 环 糊 精 相关

5、 研 究 在 国 内 尚未 见过相 关报 道 。 本课 题 组采 用 酶 法 合 成 麦 芽 糖 基一 - 环 糊 精 ， 并 对其进 行 了简单 的分离 和结 构鉴定 ， 同时对影 响产物 产 量 的各 因 素进 行 了研 究 ， 填 补 了 国 内麦芽 糖 基一 0 【 一 环糊精合成研究的空 白， 为解决技术壁垒及国内进行 麦芽糖基一 环糊精合成研究提供数据参考。 第一作者 ： 硕士( 金征宇教授为通讯作 者) 。 国际科技合作项 目( 2 0 0 7 DF A 3 1 1 2 0 ) ， 江苏省 自然科学基 金创新 学者攀登项 目( B K 2 0 0 8 0 0 3 ) ， 食品科学

6、 与技 术国家重 点实验室 2 0 0 8年度 目标 导向项 目( S KL FMB一 2 0 0 8 0 4 ) 收稿 日期 ： 2 0 0 90 2 0 5， 改回 13 期 ： 2 0 0 9 0 4一O 8 4 6 l Q !： 曼 曼 ： 鱼 ( ! ! 旦 ! 曼 曼 1 材料 与方法 1 1材料 与试剂 普鲁 兰酶 ， 无 锡 杰 能 科公 司 ； 普鲁 兰 、 麦 芽糖 - 一 环糊 精 ， 日本 WA K O公 司 ； 所 有 化学试 剂均 为分 析纯 ( A R) ； 薄层层 析硅 胶 ( G F 2 5 4) ，青 岛海 洋 化 工有 限 公 司 。 1 2 仪 器 1

7、0 1 A 2型 干燥箱 ， 上 海市 实验 仪 器总 厂 ； J B 3型 磁 力搅拌 机 ， 上海 雷磁新 径仪 器有 限公 司 ； 恒温 水浴 锅 ，上海市 实验 仪器 总 厂 ； Wa t e r s 6 0 0高 效液 相 色谱 仪 ； 紫 外 检 测 器 L i c h r o s p h e r N H 2 ( 2 12 5 0 m m) ， Wa t e r s 公 司 ； 质 谱仪 Wa t e r s P l a t f o r m Z M D 4 0 0 0 ， Wa - t e r s公 司。 1 3 方法 1 3 1 酶 活 力 的 测 定 酶 活 力 单 位 定 义

8、 ： 特 定 条 件 下 ( p H 4 5 ， 5 0 ) ， 从 普 鲁兰底 物每 分钟 释 放相 当于 葡萄 糖 的 1个 还原 当量 所需 的酶量 为 1 个 酶活力 单位 ( u ) 。 测定 方法 ： 1 m L原酶液 用 5 0 mm o l 的 乙酸一 乙酸 钠缓 冲液 稀释 至 1 0 0 0倍 ， 取 0 2 m L酶液 与 0 8 mL 质 量分 数 0 5 的普 鲁 兰缓 冲液 ， 在 5 0 下 反 应 5 mi n ， 以 S m o g y i N e l s o n比色 法测还 原糖 m 。 最 终测定 的酶 活为 4 5 2 U m L 。 1 3 2 麦芽糖

9、基 仅 一 环糊精得率计算 得 率 = 蒜慧 。 1 3 3 麦 芽糖 基 环糊精 合成 利 用 麦 芽糖 和 d 一 环 糊 精 作 为底 物 ， 以普 鲁 兰 酶 作 为催 化 剂在一 定条件 下逆 向反应 合成 Ma l - - C D。 1 3 4麦 芽糖基 一 环糊 精 的鉴定 对 1 3 3合 成 的 反 应 产 物 进 行 1 0 0 灭 酶 1 5 rai n ， 然后 稀释 1 0倍 ， 1 0 0 0 0 r m i n离 心 3 0 ra i n ， 洗脱 、 浓 缩 、 冷 冻 干燥 得产 品。用 0 4 5 m 微 滤膜 过 滤 ， 采 用 液质联 用 进 行 对 冻

10、 干 产 品 定 性 ， 采 用 E S I 一 离 子 方 式 ， 离子 源温度 为 1 0 0 ， 脱溶 剂温 度 2 5 0 ， 质量 范 围 2 0 01 5 0 0 m z 。 2 结果 与分析 2 1检测 条件 的建立 经 过 反 复 的实 验 ， 确定 液 质联 用 检 测 条件 为 ： 流 动 相 ( 乙腈 )： ( 水 )= 5 2： 4 8 ， 流速 0 3 m L mi n ， 柱 温 3 5 ， 进样 量为 1 5 L ， 标 准 品反 应 产 物 的液质 联 用图谱 如图 1所示。麦芽糖基- 环糊 精标准 品在 4 2 4 rai n处 出峰 ， 样 品在 4 2 5

11、 ra i n处 出峰 ， 出峰 时间 基 本一 致 。对 4 2 5 rai n出峰 的样 品物 质 进行 了质 谱 分 析 ( 结 果见 图 2 ) 。结 果显示 ， 分 子量 是 1 2 9 6 3 ， 与 标 准品 分子量 一 致 。液 质 联 用 比单 纯 利 用 HP L C分 析保 留时间相 同更具 准确 性 。 l 0 0 O l ( xJ 0 4 25 样 品 1 0 4 、 1 、 ， 、 - ， 2 0 0 4 00 6 0 0 8 0 0 1 0 0 0 1 2 00 保留时间 ra i n 图 1 Ma l - o t - CD标 准 品 及 反 应 产 物 HP L

12、 C图 2 2麦芽糖 基- 环糊 精 的分 离 图 3是反应 产物 经 薄层色 谱展 开后 的色谱 图 ， 对 比标样 可 以看 出薄层 色谱 能把 Ma 1 仅 一 C D和 d C D分 开 。 2 3 反应 条件 对产 量的影 响 。 研究了麦芽糖和 环糊精的摩 尔比、 反应时间、 反应 温度 、 加 酶量 、 p H 等各 因素对 产量 的影 响 。 2 3 1 反 应物摩 尔比 ( 麦 芽糖 o r 一 环 糊精 ) 对 产 量 的 影 响 l o 0 O l 2 9 6 3 1 2 97 8 1 29 5 4 l 29 8 7 6 0 5 6 。 、 f= 1 5 3 3 9 5(

13、 x 】 l 0D 0 l 5 0 0 图 2 反应产物负离子质谱图 0 i “_l l 图 3 潭 层 色 谱 图 ( 左 边 是 样 品 中 I司是 Ma l - o t CD 标准品 右边是 0 【 - C D标准 品) 控制 麦 芽 糖 与 仅 一 环 糊 精 摩 尔 比在 4： 1 、 8： 1 、 1 2： 1 、 1 6： 1 、 2 0： 1 ， 反应 温 度 5 8 ， 反 应 p H 4 5 ， 加 酶量 4 0 0 U g( 环糊 精 ) 条件 下 ， 反 应 2 8 h ， 结 果 如 图 4 。 由图 4可 以看 出 ， 反应 物摩 尔 比控 制在 一 定 范 围 内

14、( 麦 芽糖 o r 一 环 糊 精 1 6 ： 1 ) ， 产 物 的量 有所 增 加 ， 但 是 当摩尔 比增 加 到 一 定程 度 ， 反应 体 系 中 产物 产 量增 加不 明显 。 因此采用 摩 尔 比 1 6： 1 较 合适 。 、 碍 难 罪 毖 l 8 氅 图 4麦 芽 糖 与 环 糊 精 摩 尔 比对 麦 芽 糖 一 环糊精得率 的影响 2 3 2反应 时 间对产 量的 影响 控制 麦 芽 糖 与 环 糊 精 摩 尔 比 1 6： 1 ， 温 度 5 8 c I = ， p H 4 5的条件下 ， 加酶 4 0 0 U g( 环糊精 ) ， 分 别使反应时间为 1 6 、 2

15、 0 、 2 4 、 2 8和 3 2 h ， 结果如图 5所 示 。反应 2 4 h后 产物 达 到稳定 。普 鲁 兰酶 的逆 向合 成需要较长时间， 但并非越长越好 ， 一是高温长时间 反应 ， 酶的催化活力会降低； 二是随着底物的消耗 ， 产 物的生成速率将 明显下降， 综合考虑， 确定 2 4 h为反 Q Q 生 蔓 曼 鲞 蔓 垒 塑 ( 璺 蔓 塑塑 2 l 4 7 应时 间。 F O O D A N D F E R M E N T A T 1 0 N I N D U S T R I E S 图 5 反 应 时 间 对 麦 芽 糖 一 a 一 环 糊 精 得 率 的 影 响 2 3 3反 应 温度 对 产量的 影响 选择 麦 芽 糖 与 o 【 环 糊 精 摩 尔 比 为 1 6 ： 1 ， p H 4 5 ， 加酶 量 4 0 0 U g o t 一 环糊 精 ， 反 应 2 4 h ， 在 4 5 6 5 时的产量情