抗菌抗病毒常用实验研究方法

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1、抗菌抗病毒常用实验研究方法抗菌抗病毒常用实验研究方法细菌、病毒性疾病是目前国内外流行的主要传染病,尤其是近两年来,由冠 状病毒引起的 SARS 及由流感病毒引起的禽流感给动物及人类带来的严重危害, 是人所共知的“由于各种疫苗的不断出现,虽然一些细菌、病毒病已得到了有效 的控制,但是其治疗尚无有效的解决方法因此研制高效、低毒的新型中药抗菌、 抗病毒制剂已成为巫待解决的问题。 1 1、常用的抗菌方法、常用的抗菌方法 1 1、1 1 稀释法稀释法 1 1、1 1、1 1 试管稀释法试管稀释法 培养基内抗生素的含量按几何级数稀释并接种适量的细菌，经孵育后，观 察能引起抑菌作用最低抗生素浓度，称最低抑菌

2、浓度(MIC)为该菌对药物的敏感 度。稀释法所获得的结果比较准确，常被用作校正其他方法的标准。如以下黄 贝贝等的青钱柳抗菌作用的实验研究和黄利权等的火绒草的抗菌活性研究的实 验方法: 1、应用试管稀释法,测定青钱柳提取物对试验菌的抑菌效果,检验不同浓度 下青钱柳提取物对细菌、霉菌的抗菌作用。结果:青钱柳提取物在体外对金黄色 葡萄球菌、乙型溶血性链球菌等革兰氏阳性菌具有较强的抗菌作用;而对大肠埃 希氏菌、铜绿假单孢菌等革兰氏阴性菌的抗菌作用不明显;对黄曲霉、烟曲霉等 霉菌的抗菌作用不明显1。 2、采用试管稀释法,分别测定了火绒草水煎液、水提醇沉液、醇提物、醇 提石油醚部分、醇提乙酸乙酯部分、醇提

3、正丁醇部分、醇提水溶部分等 7 种提 取物对大肠杆菌 C83882、大肠杆菌 C83903、大肠杆菌 C83914、沙门氏菌 C79- 20、金黄色葡萄球菌 Newbould S-305、金黄色葡萄球菌临床分离株等 6 株病原 菌的最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)。试验结果表明,火绒草醇提物及 其石油醚部分和乙酸乙酯部分对两种金黄色葡萄球菌具有较强的抑制作用,其 MIC 为 0114 mg/ml 生药浓度,MBC 为 0127 mg/ml 生药浓度,而其它部分对金黄色 葡萄球菌的抑制作用较弱。火绒草醇提正丁醇部分和水溶部分对 3 株大肠杆菌 和 1 株沙门氏菌具有较强的抑制作用,

4、其 MIC 为 2170 mg/ml 生药浓度,MBC 为 2170 mg/ml 生药浓度,显示了较强的抗菌活性2。 1 1、1 1、2 2 肉汤稀释法肉汤稀释法 以水解酪蛋白(M-H)液体培养基将抗生素作不同浓度的稀释，然后种入待检 细菌，定量测定抗菌药物抑制或杀死该菌的最低抑菌浓度(MIC)或最低杀菌浓度 (MBC)。 如刘菁菁的研究蓝玉簪龙胆对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌( MRSA) 的体内 外抗菌活性。蓝玉簪龙胆分别以乙醇、氯仿、正丁醇、蒸馏水提取，得到极性 不同的 4 部分产物，利用肉汤稀释法测定其对 MRSA 和甲氧西林敏感金黄色葡 萄球菌( MSSA) 的最低抑菌浓度( MIC)

5、; 体内实验部分: 采用腹腔注射 MRSA 法建立小鼠感染模型，分别给予蓝玉簪龙胆水提液高、中、低剂量，银黄胶囊 治疗 15 d，并与模型对照组比较，观察存活率。结果：体外实验: 蓝玉簪龙胆 各极性组分对 MRSA 和 MSSA 菌株均有不同程度的抑菌作用，其中正丁醇组分 抑菌作用最强，其次为乙醇、水层组分; 体内试验: 除了蓝玉簪龙胆大剂量组， 其余各治疗组存活率均高于模型对照组，而蓝玉簪龙胆中剂量组存活率最高。 结论 蓝玉簪龙胆对 MRSA 和 MSSA 均具有一定的抗菌作用，而且敏感性差异无显著性; 对 MRSA 感染小鼠有一定治疗作用3。胡景玉等为了了解衡水地区大 肠埃希菌的药敏情况，

6、采用肉汤稀释法 18 种抗菌药物最低抑菌浓度（MIC）并 计算其 MIC50和 MIC90。结果亚胺培南、哌拉西林、他唑巴坦和头孢哌酮、舒巴 坦显示良好的抗菌作用，其 MIC50分别为 0.5 g/ml、1 g/ ml、0.5 g/ ml；MIC90均为 2 g/ml，其他药物显示不同程度的耐药，且大肠埃希菌产 ESBLs 的检出率较高。结论检出的大肠埃希菌存在多重耐药，仅对亚胺培南、 哌拉西林、他唑巴坦和头孢哌酮、舒巴坦普遍敏感4。Kianbakht S 等通过肉 汤稀释法研究刺蒺藜不同部位（果、茎叶、根）的甲醇提取物对金黄色葡萄球 菌 ATCC 29213、粪肠球菌 ATCC 29212、

7、肠埃希氏菌 ATCC 25922、绿脓杆菌 ATCC 27853 四种细菌的抗菌能力，研究结果表明：果、茎叶对四种菌的 MIC 值 均为 2mg/ml；根的甲醇提取物对 MIC 值对金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、肠埃希 氏菌均为 4mg/ml，对绿脓杆菌的 MIC 值为 2mg/ml5。 1 1、1 1、3 3琼脂平板稀释法琼脂平板稀释法将不同浓度的抗菌药物，分别加入到定量的琼脂培养基中，混匀，制成固 体含药平皿，使每一个平皿中所含抗菌药物的浓度相差 2 倍，用多点接种仪把 待测细菌点种到含有抗菌药物的琼脂培养基的表面上，在特定温度下培养适当 时间后，平皿上无菌落生长的最低药物浓度为抗菌药物对受试

8、菌种的最低抑菌 浓度。每一次实验都应用标准菌株做质控。琼脂平板稀释法本法的特点是可同 时进行大量菌株的药敏测定。也适用于中草药和厌氧菌的药敏测定。 如汪黎虹等应用超微粉碎法将虎杖、石榴皮、马齿苋、苦楝皮、大黄等 10 种中药进行加工处理至粒径为 510m 后，利用琼脂稀释法测定其实验室近年 来收集的患病鳗鲡中分离得到的 18 株常见致病菌的抑菌作用。结果表明: 上 述 10 种中药单用对除 B12 肺炎克雷伯菌以外的 17 株养殖鳗鲡主要致病菌均有 一定的抑制作用，其平均抑菌浓度( MIC) 范围为 0. 165128 mg /mL，平均杀 菌浓度(MBC) 范围为 0. 210128 mg

9、/mL6。 1 1、1 1、4 4浓度梯度法浓度梯度法浓度梯度试验是一种定量的抗生素药敏测定技术，可用于非苛养革兰阳性 和阴性需氧菌(如肠杆菌、假单胞菌、葡萄球菌和肠球菌)以及苛养菌(如厌氧菌、 肺炎链球菌和嗜血杆菌)的药敏测定。该系统包含有一个预先制备好的抗生素浓 度梯度，可用于在琼脂培养基判断某抗生素对微生物的最小抑菌浓度(MIC)。如 刘芳等的武汉地区住院患儿感染肺炎链球菌的耐药状况。 如刘芳等的收集医院2009年1-12月住院患儿分离的肺炎链球菌1521株, 采 用纸片扩散法及E-test法进行抗菌药物敏感试验;按CLSI 2008 年版判断结果； 使用X2检验分析耐药性的变化。研究结

10、论为武汉地区住院患儿分离的肺炎链球 菌对红霉素、克林霉素、四环素及磺胺甲噁唑、甲氧苄啶的敏感率极低, 对左 氧氟沙星及万古霉素均有极高的敏感率, 对青霉素仍保持较高的敏感率, 可作 为治疗普通肺炎链球菌感染的首选药物7。 1 1、1 1、5 5 试管两倍稀释法试管两倍稀释法 试管两倍稀释法取生长浊度达 9108mg/ml 菌液，菌液用培养液稀释，接 种于无菌试管中，然后加入不同浓度的抗菌药物或未知药物，37孵育。 1624 h，以无细菌生长的最低浓度为 MIC。将无细菌生长的完全清晰液再移 种于不含抗菌药物的血平板中，经 37过夜培养，菌落数不超 5 个的平板的最 低药物浓度即为该药物的 MB

11、C。一般以 MIC 来评价细菌对药物的敏感度。 马加庆等的采用试管两倍稀释法观测利胆止痛胶囊在体外对甲型溶血性链球菌、乙型溶血性链球菌、金黄色葡萄球菌及痢疾杆菌、大肠杆菌和沙门菌生 长的影响研究结果表明：利胆止痛胶囊对金黄色葡萄球菌、甲型溶血性链球 菌、乙型溶血性链球菌、痢疾杆菌和大肠杆菌的 MIC 分别为 25、50、50、25 和 12.5 mg/mL，对沙门菌无明显抑菌作用8。 1 1、1 1、6 6 微量肉汤稀释法微量肉汤稀释法 微量肉汤稀释法的原理：原理同肉汤稀释法。石功名等的对西他沙星与莫 西沙星抑制细胞内外金黄色葡萄球菌ATCC25923的活性进行体内外研究，采用微 量肉汤稀释法

12、检测药物的MIC，MBC及MPC，研究结果表明：在体外实验中， MIC，MBC，MPC及时间与浓度杀菌曲线实验表明西他沙星胞内外抑菌活性均强于 莫西沙星9。 1、1、7微量稀释法微量稀释法 微量稀释法本法为改进的试管稀释法。取稀释菌液接种在 96 孔板中，然后 加入待试抗菌药物，混匀后放置 37孵育 1624 h，在衬有黑底板的光线下观 察，细菌生长时小孔呈弥散状混浊或在孔底部有圆形或丝状的沉淀；无细菌生 长时孔内所含最低抗菌药物浓度即为 MIC。把无细菌生长孔内液体移种不含抗 菌药物血平板中，菌落数少 5 个的平板的最低药物浓度即为 MBC。 如宋晓晶等通过微量稀释法分别测定特比萘芬、氟康唑

13、、伊曲康唑、制霉 菌素对 38 株临床分离的口腔念珠菌的体外敏感性。研究结果表明：38 株白念 珠菌对氟康唑耐药 4 株, 敏感 34 株; 对伊曲康唑耐药 5 株, 敏感 33 株; 对特 比奈芬耐药 15 株, 敏感 23 株; 制霉菌素均敏感10。 1 1、2 2 纸片琼脂扩散法纸片琼脂扩散法 琼脂扩散法是将抗菌药物加至接种试验菌的平板表面，抗菌药物在琼脂胶 内向四周自由扩散，其浓度随扩散距离增大而降低，在药物一定的扩散距离内， 由于药物的抗菌效应，试验菌不能生长，此无菌生长的范围称为抑菌圈，抑菌 圈的大小与药物的抑菌效应成正比。 如熊枫等的从西太平洋近赤道区采集到的 18 个深海沉积物

14、样品中分离到 83 株海洋真菌,采用滤纸片琼脂扩散法和 MTT 法分别对其发酵液乙酸乙酯抽提 物的抗菌、抗肿瘤活性进行筛选.结果显示,有 37 株菌株对至少一种指示菌有抑 制作用;有 29 株菌株对 KB 或 Raji 肿瘤细胞具有显著的抑制活性,分别占总供测 菌株的 44.6%和 34.9%.在抗肿瘤活性菌株中,WP-M-1、DY-G-2、DY-C-2、WP-K-3 和 WP-Q-2 等 5 株菌具有很高的活性,其发酵液乙酸乙酯抽提物对 Raji 细胞的 IC50 分别为 5.000、1.064、2.796、1.920、0.520Lg/mL.研究结果表明,海洋沉 积物来源的真菌中蕴藏着丰富的

15、抗菌及抗肿瘤活性代谢产物产生菌,是开发抗菌 和抗肿瘤药物的宝贵资源11。又如邬晓勇等的建立了蛙皮抗菌肽的活性测定方 法TTC 微量稀释法; 利用 SephadexG25 凝胶层析分离抗菌肽粗品获得一 个活性组分命名为 G5，利用 TTC 微量稀释法测定活性组分 G5 抑制大肠杆菌 的 MIC 是 80g/mL、抑制铜绿假单胞菌的 MIC 是 20 g/mL、抑制金黄色葡 萄球菌的 MIC 是 80 g/mL; 活性组分 G5 再经凝胶 HPLC 分离纯化获得两个 活性组分和，组分和组分再分别经过 RP-HPLC 分离纯化获得两个色谱 纯的活性组分命名为 Rana和 Rana12。 1 1、3

16、3 平板稀释法平板稀释法 如吴决等的探讨抗菌性中药药物敏感试验在鉴定中药新药上的应用。应用 中药药敏试验平板稀释法鉴定中药新药/万力通 0 对常见十余种细菌的最低抑菌 浓度(MIC).结果 运用平板稀释法测定中药新药 MIC,效果理想.结论 在中药药敏试验诸方法中,平板稀释法鉴定中药新药抑菌作用,方法简便,易操作,结果易 观察13。 1 1、4 4 打洞法打洞法 如向红采用平板打洞法对西南委陵菜(Potentilla fuigens)的全草、根、 叶的水煎剂进行体外抗菌实验。结果表明,全草、根、叶的水煎剂对 G-大肠杆 菌、G-志贺氏痢疾杆菌、G+金黄色葡萄球菌均有抑菌作用。不同的入药部位对 同一细菌的抑菌能力不同,作用的强弱与药液浓度的大小有关;同一入药部位对 不同细菌无明显选择抑制作用14。再如袁婷等常见中草药的体外抑菌试验，应 用体外抑菌试验的平板打洞法、试管两倍稀释法和平板培养法对本地常见中草 药一枝黄花、黑老虎、土甘草