固定化技术在医药上的研究应用

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1、固定化技术在医药上的研究应用摘要摘要:综述了固定化技术的制作方法及载体的选择，以及固定化技术在医药方而的研究与应用，并对固定化技术的应用前景及存在的问题进行了评述。关键词关键词:固定化技术;定点固定化;无载体固定化;医药 固定化技术是从 60 年代开始迅速发展起来的一项新技术，它是通过采用化 学或物理的手段将游离细胞或酶定位于限定的空问区域内，使其保持活性并可 反复利用的一种基本技术。七十年代后，固定化微生物技术直接从固定化酶技 术发展而来，微生物细胞固定化的方法多种多样，任何一种限制细胞自由流动 的技术，都可以用来对微生物细胞进行固定化。固定化酶、固定化微生物细胞、 固定化动植物细胞、生物传

2、感器以及生物反应器的研究迅速发展，形成了一个 范围广泛的固定化生物催化剂的研究领域。固定化技术已广泛应用到食品与发 酵工业、有机合成工业北学分析、医疗诊断、环境净化及能源生产等各个领域， 充分显示其美好前景。 而固定化在生物技术方面最主要的应用领域是固定化酶，因为固定化酶以 其特有的优点而具有广阔的发展前景。它的最大特点是既具有生物催化剂，又 具有固相催化剂的特性。与天然酶相比，固定化酶具有以下优点：可以在较 长时间内多次使用，而且在大多数情况下，酶的 稳定性提高。如固定化的葡萄 糖异构酶，可以在 6065。C 条件下来连续使用超过 1000h。固定化黄色短杆菌 中的延胡索酸酶用于生产 L-苹

3、果酸，连续反应一年，其活力仍保持不变。反 应后，酶与底物和产物易于分开，产物中无残留酶，易于纯化，产品质量高。 反应条件易于控制，可实现转化反应的连续化和自动控制。酶的利用效率 高，单位酶催化的底物量增加，用酶量减少。比水溶性酶更适合于多酶反应。1固定化方法1 1载体选择固定化技术中使用的载体需符合如下条件:固定化过程中不引起活性丧失;对 酸、碱有一定的耐受性;有一定的机械强度;有一定的亲水性及良好的稳定性;有 一定的疏松网状结构，颗粒均匀;共价结合时具有可活性基团;廉价易得等。目前 用于结合法的载体主要有:碎石、卵石、煤渣、焦碳、硅藻土、多孔砖、石英砂、 硅胶、沸石及活性炭等，它们可分别应用

4、 于不同的处理工艺。用于包埋法的材料有聚乙烯醇(PVA) ,聚丙烯酞氨( ACAM) , 聚乙烯乙二醇( PEG ) ,琼脂、海藻酸钙、角义菜胶和聚丙稀酸等。值得注意的是， 通常载体都要经过活化后才能用于固定化技术，例如对于纤维素载体通常要引 入脂肪族或芳香族氨基、梭基或硫羟基来活化羟基。1 2固定化方法的选择固定化方法中研究最多的是酶固定化方法，酶的固定化方法可增加酶的稳 定性。目前主要的固定化方法有:1 2.1载体结合法 载体结合法是结合于不溶性载体上的一种固定化方法，根据结合形式的不同，可分为物理吸附法、离了结合法和共价结合法 3 种。1 2.2交联法 交联法是用双功能基团或双功能试剂，

5、使酶与酶或细胞与细胞之问交联的固定化方法。这一固定化方法附着牢固，不易漏失，但由于固 定化过程中涉及化学反应，因而失活现象较为严重。1 2.3包埋法 包埋法是将酶或细胞包埋于聚合物中的一种固定化方法，主要有以下儿种类型:网格型、微囊型和脂质型。包埋法制备方法简单，条件温 和，一般不涉及酶分了的化学变化，因而酶活力回收率高，但是酶容易漏失， 催化反应受传质阻力的限制，不易催化大分了底物的反应。1 2.4选择性热变性法 选择性热变性法是将细胞在适当温度下处理使细胞膜蛋白变性，但不使酶变性而使酶固定于细胞内的方法。1 2.5定点固定化技术 定点固定化技术是借助分了生物学方法，通过酶蛋白上的特定位点与

6、膜载体作用，在膜表面形成一种高度有序的酶分了的二维 阵列。酶蛋白上的作用位点远离催化活性中心，使底物能充分接近活性中心。 定点固定化方法主要有 3 种:抗体偶联法、生物素亲和素亲和法和氨基酸置换法。 与随机固定化方法相比，定点固定化技术的活力和固定量都有显著提高。1 2.6无载体固定化技术无载体固定化技术取得的重大突破是交联酶结晶( CLECs)技术1，CLECs 是一种无需载体、既有纯蛋白的高度特异活性又对有机 溶剂具有高度耐受性的生物催化剂。2000 年荷兰 Delft 大学的 Sheldon 小组提出 一种用盐、有机溶剂或非离了聚合物等沉淀剂沉淀酶蛋白，得到酶聚集体，再 用戊二醛交联的无

7、载体固定化方法交联酶聚集体(C LEA s)技术2。C LEA s 技术是继 CLECs 之后的又一种无载体固定化技术。近儿年，交联酶聚集体技术 已被成功地应用于青霉素酞化酶、脉酶、氧化还原酶和 7 种不同微生物来源的 脂肪酶的固定化。1 2.7联合固定化技术 联合固定化技术最初是把外来酶结合于固定化完整细胞上，后来人们又发展到将两种酶、两种微生物细胞以及生物催化剂(酶细 胞)与底物或其他物质联合固定在一起。联合固定化技术是酶、细胞固定化技术 发展的综合产物，与普通固定化技术相比，可以充分利用酶和细胞的各自特点， 把不同来源的酶和细胞的生物催化性质结合到一起。多种酶同时固定在膜材料 上，利用各

8、自的功能协同催化复杂的生物转化过程是固定化研究的一个新方向， 此外，酶还可以与细胞及其它一些生物分了共固定，构成更为复杂的生物转化 体系。1 2.8藕合固定化技术6 藕合固定化是指儿种固定化方法或载体的联合使用，即添加稳定因了和促进因了的固定化方法。藕合固定化基本上能够解决 单一固定化方法酶活回收率低、稳定性差转质阻力差等问题，并具有方法多样、操作简便、技术成熟等特点。随着人们对固定化酶微环境认识和研究的进一步 加深，藕合固定化技术3将逐步成为研究的热点。Culla KC4等在酶的固定化过 程中添加了一些抗生素和盐，它们能和二硫键还原产生的硫醇(如 B-巯基乙醇, N-乙酰马来酰亚胺)相互作用

9、，降低硫醇含量达到稳定酶活力的目的。 2固定化技术在医药方面的应用2 1 抗生素上应用自 20 世纪 70 年代初，欧美国家已开始用特殊的合成树脂固定化青霉素酞 化酶来生产 6 -APA5，但价格昂贵，酶活还较低。中国关于固定化青霉素酞化 酶的研究工作起步较晚，还要靠进口价格昂贵的固定化载体或固定化青霉素酞 化酶来满足半合成青霉素生产的需要。2 1.1 用于生产 内酞胺类抗生素中问体青霉素酞化酶在偏碱性环境下，可以催化青霉素 G 和头抱菌素 G 水解，制备生产半合成 p 内酞胺类抗生素所需 的中问体:6-氨基青霉烷酸(6 -A PA)和 7 氨基脱乙酞头抱烷酸7(7 -ADCA )。传 统上多

10、采用氧化反应酒旨化及扩环重排等化学反应来合成 7- ADCA，但其过程 存在着步骤多、反应条件要求高、成本高、三废污染等问题，现在已逐渐被固 定化方法所替代。2 1.2 用于生产半合成 内酞胺类抗生素固定化青霉素酞化酶在酸性环境中可催化 6APA,7AD-以发生酞基化反应制备半合成抗生素，该方法具有稳定 性好、转化率高、产品纯度高、污染少、成本低等优点，受到人们的重视。2 2 氨基酸上应用氨基酸是蛋白质结构的基本单位，对维持机体蛋白质的动态平衡有极其重 要的意义。自然界的天然蛋白质中存在 20 余种基本氨基酸，皆为 L 型，非基 本氨基酸多为外消旋体，然而 D 型和 L 型对映体的生理作用迥异

11、。氨基酸主要 通过发酵法和合成法生产，D-氨基酸一般通过光学拆分得到。D-氨基酰化酶利 用其立体专一性反应，从化学合成的底物生产具有光学活性的 D -氨基酸蒲广西等研究了利用基因重组工程技术构建高活性的氨基酞化酶工程菌 连续拆分 D, L 蛋氨酸9。氨基酞化酶工程菌经发酵收集高活性的菌体，通过 海藻酸钠包埋技术制备固定化酶，连续拆分 D,L 蛋氨酸，结果比酶活性大于 6 000 u/g 湿菌体，酶柱比酶活性大于 4 000 u/g 酶，半衰期 20d,可连续拆分 24d,拆 分率达 90%，收率达 74.5%左右。随着基因工程药物和固定化技术的发展，人 们对 D 氨基酸的需求日益增加，因此筛选

12、具有高活力 D 氨基酰化酶的菌株，并 且建立起简单快捷生产 D 氨基酸的方法有着广阔的工业前景。2 3 酶制剂上应用脂肪酶不仅能够催化酷的水解反应，而且能在有机溶剂中催化醇和酸的酷 合成反应酒旨交换反应、氨解反应驮合成反应等等。陈秀琳研究以 cM-纤维素 10为载体固定化脂肪酶的最适制备条件，固定化酶的酶学特性以及操作的稳定性，结果表明本法制备得到的固定化酶酶活力较高，回收率也较高，最适温度， pH 都有了提高，稳定性也提高了，酶和载体问的结合力较牢固。目前脂肪酶制造油化学品的重要障碍就是脂肪酶价格较高，而固定化酶具有可以回收、重复 使用、稳定性高产品质量高等优点，所以脂肪酶的固定化技术可以在

13、药物制备、 食品及轻工等方面广泛应用。固定化胰蛋白酶11( imm ob ilized trypsin,IFP )是人胰岛素固相酶促半合成转 化反应中的催化剂，高秀蓉等对其催化特性和稳定性与固定化之前相比进行了 研究，发现胰蛋白酶经固定化后，最适作用 PH 值范围变窄，最适作用温度和 Km 值升高，热稳定性和酸碱稳定性均有所增强。2 4药物筛选上应用药物筛选就是对可能作为药物的物质进行初步的药理活性的检测和试验， 以求发现其药用价值和临床用途，为发展新药提供最初始的依据和资料。传统 的药物筛选方法是采用药理学的方法，通过体内、体外多种试验，评价药用样 品的药学活性。直到 20 世纪 70 年代

14、中期，动物实验一直是药物筛选的主要方 法，但动物实验存在需时长、劳动强度大、操作技术要求高、受试样品需要量 大等缺点。现代科技的发展为高效率的筛选药物提供了技术条件，高通量药物 筛选技术12(HTS)就是将多种技术方法有机结合而形成的一种新的技术体系。在高通量筛选中，邻位闪烁分析13(Scintillation-Prox in ityA ssay)由于具有 检测灵敏度高，分析适用性宽和无须对反应物及底物进行繁琐的分离等优点已 发展为高通量筛选实验室最常见、最基本的分析检测手段之一。基本原理是将 靶分了(受体、酶或相关大分了)固定于含有荧光闪烁剂的微球表面，当发生标 记的配基与受体亲合时，标记的

15、同位素释放的粒了就会激活微球中的闪烁剂产 生荧光;反之无亲合作用时，放射性同位素距离闪烁剂较远，无法激活闪烁剂， 故不产生荧光。从邻位技术的基本过程看，药物筛选涉及靶分了固定化和配靶 亲合等亚过程，药物的疗效取决于分了自身的结构及靶分了的构像，固定化能 对靶分了构像造成一定的影响，固定化过程中可能存在的靶分了与靶分了、靶 分了与微球、体相与表面相之问存在的相互作用，因此邻位筛选的效果依赖固 定化方法。用于药物筛选的膜蛋白微阵列，由于类脂环境影响膜蛋白的功能难以很好 发挥，使微阵列制作有困难。最近微阵列技术取得了突破性进展，解决了膜和 蛋白的固定化问题，发明了一种机械上稳定又允许单个分了在固定化

16、膜内移动 的系统，这种水平方向流动性是生物膜的特性之一。随着国际药物研究形势的发展，开发具有自主知识产权的新药已迫在眉睫， 我国天然资源丰富，应用高效的药物筛选方法，利于从海洋生物、中药材植物 资源中开发出具有自主知识产权的新药。2 5 手性药物上应用手性药物的临床意义已引起了人们的注意，并成为国际开发热点，世界正 在开发的 1 200 种新药种有三分之一是手性药物，同时手性药物又是药品开发 中的难点，往往是一种对映体具有很大的药用价值，而另一对映体没有药效， 甚至对人体有毒害作用。如何从对映异构体中分离出有效成分或合成有效成分 是目前面临的一大课题。青霉素酰化酶12对 L 型氨基酸具有极高的选择性，在 固定化青霉素酰化酶作用下，很容易使 L-苯甘氨酸和 D-苯甘氨酰胺合成 D-甘 氨酰胺-L 甘氨酸，其可进一步环化为具有立体构象的 D, L-3,6-苯哌嗪-2, 5-二酮。 3，6-二苯哌嗪-2，5-二酮的这两个异构体具有较多的应用价值，不但可用作食品