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1、塑料细菌？细菌生产聚羟基脂肪酸酯的进展与前景 聚羟基脂肪酸酯是由许多细菌合成为能源和碳存储化合物,也是一种适合生物降解塑料材料。 根据最新研究结果，有几种细菌通过供料培养可获得 PHA 浓度大于 80g/L-1及生产率大于 2gPHA/L-1h-1的结果。生物代谢工程方法扩大了可利用的基质范围和改善了 PHA 生产方法。 这种方法的优点可以降低当前美国市场 PHA16 美元一公斤的高昂价格，使得 PHA 在不久的 将来成为一种占市场统治地位的可生物降解材料。 为了让公众增加对石化合成塑料对环境危害性的认识，很多国家出台了针对各种固体废弃 物管理政策，其中都包括发展可生物降解塑料以减少废弃塑料的
2、政策。这些生物可降解塑 料材料必须所需的保留传统合成塑料材料性能, 当被丢弃后应该完全降解而不留下任何不 良的残留。PHA 是由多种羟基脂肪酸在含有丰富碳源及必要氮磷等营养素的条件下合成的， 它是一种储能材料。PHA 还被看成一种可替代合成塑料的材料，因为它拥有当下使用的聚 丙烯塑料及合成橡胶相似的热塑性及弹性，并且使用后它可以在土壤、大海、湖泊、下水 道等各种条件下被微生物完全降解为水和二氧化碳（在厌氧条件下降解为甲烷） 。 聚 3-羟基丁酸P(3HB)是 3-羟基丁酸的均聚物，它是一种被广泛使用性能优异的 PHA 材料。许多细菌在合适碳源条件下可以合成拥有不同单体结构的 PHA，通常这些结
3、构上的不同会 影响 PHA 成分的不一样。由于合成酶的定向性 PHA 中的单体结构都是 D-(-)。在不同细菌中 合成的超过 90 种不同的单体结构被鉴别出来，其中包括含有 3-12 个碳原子及各种 R 侧链 的 3 羟基酸脂，含有 4-8 个碳原子的 4 羟基烷酸。但是这些单体结构中只有少部分的生产 量可以满足性能表征需求以达到应用目的。 聚 3-羟基丁酸是一种部分结晶高聚物，它的性能和聚丙烯相似。然而由于它热稳定性能不 好又太脆阻碍了工业应用。英国化学工业公司旗下的 ZENECA 生物制品公司开发的 3 一轻 基丁酸和 3 一轻基戊酸的共聚物 P(3HBco-3HV)具有比聚 3-羟基丁酸
4、更好的柔韧性，可以被 用来制造许多物品，比如胶片、铜版纸、一次性餐饮用具及瓶子等注塑制品。P(3HBco-3HV) 被大量生产并且 BIOPOL 品牌的制品在市场售价高达 16 美元一公斤。而同样的聚丙烯塑料 售价只有 1 美元每公斤，因此价格问题是阻碍 PHA 商业应用的主要原因。人们已经投入大 量精力去想办法降低成本，比如培养更好的菌株、开发更高效和经济的发酵及处理工艺流 程。最近的许多综述论文中也关注了以下方面研究：PHA 的一般性能研究，PHA 生物合成 中的生理和基因研究，物理化学性能研究，产品及后处理研究。本文主要关注了各种不同 细菌生产的 PHAS 产品的处理方法及应用前景，以及
5、讨论了菌株改良和新型合成物的现状 及未来发展。 产品策略 虽然很多种 PHA 见诸于各种论文，但只有其中很少部分材料性能好的能够投入应用。它们 是 P(3HB),P(3HB-co-3HV),P(3HV),聚(4-羟基丁酸)P(4HB)和聚 (3-羟基己酸 -co-3-辛酸) P(3HHx-co-3HO)。其他还有 PHA 由于比如基质昂贵或有毒，菌株培养困难，聚合物积累太 慢等各种原因，只是少量生产。目前已发现超过 300 中细菌可以产生 PHA，但只有如产碱 杆菌属(Alcalligenes)、假单胞菌属(Pseudomonas)、甲基营养菌(Methylot 汽少 hs)、固氮菌属 (Az
6、otobacter)和红螺菌属 (Rhodo 胡 irillum)等少数几种被用于生产。这些菌种都是由于它们 具有容易达到高的细胞密度来获得 PHA 高出产量（定义为 PHA 出产量对生产细菌干细胞浓 度的百分比） ，而所需要时间较短，所以生产能力（定义为细菌生产 PHA 的生产速率 KG/L*H）很高。高生产率是选择生产这些生物可降解聚合物生物反应器的一个最重要因素。 碳源是基质成本的重要组成部分。在同一反应环境中，PHA 在碳源中的生成率（定义为每 克碳源能生产多少 PHA 物质）应该做到尽可能高而不是浪费在生产非 PHA 物质。在一个给 定的条件下，应当使用单位时间累积的 PHA 的量来
7、衡量细菌的生产能力。高的 PHA 积累量才有高的 PHA 转化率，这对于恢复过程是有好处的。 发酵策略 细菌用于生产 PHA 的过程由于合成方法内容不同可分为两个类别。第一个类别细菌是合成 过程对 N,R,Mg,K,O,S 及富余碳源有严格要求，而第二个类别细菌对营养素没有要求，在生 长过程中积累出 PHA 产物。产碱细菌、滴虫菌及食油假单胞菌及其他多种细菌属于第一类 别，而其他诸如一些固氮菌的变异体及重组大肠杆菌等属于第二类别。因此，在培养高效 生产 PHA 细菌时因充分考虑这些特点，这就产生了连续生产及间歇生产两种不同的 PHA 积 累方法。 在第一种类别的细菌适用于使用间歇生产方法，其中
8、两步积累法（并不需要使用两个不同 的发酵容器）应用广泛。首先在不加入营养素让细菌生长到要求浓度，再向其中加入控制 内容的营养素使细菌合成积累 PHA 物质。在有营养素阶段，剩余细菌浓度（定义为细菌总 浓度去 PHA 浓度）是不变的，而细菌总浓度的增加只是由于 PHA 的累积。真养产碱杆菌目 前被大量应用于商业生产 P(3HB),P(3HB-co-3HV)，因为它把 N、P 消耗光后可积累的 PHB 可 达细胞干重的 80%以上。虽然嗜油假单胞菌 Ps. Oleovorans 及 Pr. Extorquens 也属于第一种 类别，但是它们在培养过程中对 N、P 的消耗不尽。所以在应用这类细菌时，
9、应当优化营 养素中组分比例来获得高产量。因为在同一干细胞浓度中，营养素会严重影响最终产物产 量，所以应当通过优化使得每一个菌株都被充分利用。过早的限制营养素虽然可能使得细 胞中 PHA 高含量，但也会使细菌浓度和 PHA 浓度过低，导致最终产量降低。如果营养素限 制太晚，可以得到高的干细胞浓度，但是细胞中 PHA 含量会很低。这个结论已经在使用 AI. Eutrophus 的实验中被证明，实验中控制营养素中 N 含量在 30 和 50 g/L-1，分别得到 P(3HB) 含量为 71 和 92 g/L-1。随后再进一步控制 N 含量，可以使干细胞浓度到达 70 g/L-1，最后 P(3HB)浓
10、度可到达 121 g/L-1，干细胞浓度达到而当 90 g/L-1，P(3HB)浓度及产量却降低了。 A high residual cell concentration with a high PHA content will give the best results but there exists an upper limit of PHA concentration that can be obtained owing to the maximum cell concentration practically achievable in a fermentor (e.g. ca. 2
11、80 gl -). This can be better understood by the following simple equations:在间歇生产模式中，营养素控制对发酵成功与否至关重要。由于氮源来源复杂，诸如玉米 汁、酵母提取物及鱼蛋白都可以被用来加强 PHA 积累生产，因为这些细菌中 PHA 合成不依 赖于营养素控制。细菌生长和 PHA 积累应当平衡，避免单纯追求 PHA 导致细菌发酵终止或 者产量降低。这样干细胞浓度和 PHA 生成量之间就存在一个有意思的关系。因为 PHA 在细 胞质积累,剩余细胞浓度将决定有多少可能产生 PHA。细胞中 PHA 生产量多而干细胞浓度低 会导
12、致 PHA 积累量和总生成率低。高干细胞浓度但低 PHA 含量也会减少最终 PHA 浓度、 生产力和产量。一个高的干细胞浓度同时 PHA 含量高才是最理想的结果，但是也存因为发 酵罐能容纳的最大细胞浓度所导致的 PHA 累积量上限（真养产碱细菌为 280gL-1，重组固氮 细菌为 200 gL-1） 。以下的公式更好说明这一问题：弄清楚是什么导致细菌生长很重要。在大多数情况下，当生产能力最高时应当停止发酵进 行，而让细胞去生产和积累 PHA，但是这也会降低最终的 PHA 产量。适当推迟来实现更高 的 PHA 浓度与稍低的生产力将是有利的，这时 PHA 的含量也增加,而且更容易会让细胞有 时间复
13、苏。理论上来说，持续让细菌生长会获得较高的生产量。迄今为止，AI. latus 和 Ps. oleovorans 是仅有的采用持续培养方法来生产 PHA 的。Lageveen 等人通过研究 E coli 菌的 PHA 合成 途径发现，这一途径合成的 PHA 单体，其碳数往往比底物中的碳源碳数相差 2n(n0)个， 这也正是有机脂肪酸 氧化途径的代谢的结果。有机脂肪酸可以作为合成中长链 PHA 的良好底物，通过 氧化途径，有机脂肪酸可以产生羟基烷酸-CoA，形成中长链的 PHA。尽管连续培养其他 PHA 生产商尚未被报告过,一个总体策略可以建议如下。一个两级 恒化器适用于大多数细菌属于第一组。对
14、于那些第一组细菌，不需要考虑限制营养素浓度 来平衡细胞生长阶段和聚合物积累,如 ps oleovorans,单程恒化器就可以了。然而,两级恒化 器肯定也会导致这些细菌 PHA 生产力更高。属于第二组的细菌可以连续培养,单程恒化器适 用它们。 最近,一个关于 Al.eutrophus 两阶段连续过程的模型研究已经被报道,它可以研究如何获得 PHA 生产能力最大化。在浓度减少速率为时，优化细胞和 PHA 浓度在第二发酵罐分别是 75 和 44.8 gl t，获得生产力 2.86 glPHA 。两级生产法是一级生产法的 1.7 倍。需要做更多的实， 在过程没有任何问题,如方法不稳定和污染，去看看连续
15、培养比间歇式生产是否能真正带来 更高的生产率。特别是 AI. latus 重组 E. coli 及其他几个细菌联合生长方式似乎适合应用在 恒化器中进行。虽然，这种方法较连续生产法低，但是综合考虑生产率和转化率及经济性 的话，还是应当仔细考虑。 碳基质及转化 除了恢复阶段外，对成本影响最大的就是基质的消耗。因此，对基质的利用效率很重要， 这还可以用来预测合成中的生理学和生物学机理。在基质中，碳源对 PHA 合成的影响最大。 碳源有很多种，比如醣类物质、油、酒精、酸、烃类等，都可以被多种细菌使用。目前， 人们利用合成 P（3HB）的过程对各种碳源进行评价，再生烟酰胺核苷酸被用于合成 PHA 就是这
16、样来的。它也暗示实际总收率与比例理论产量和 PHA 含量成比例。表 1 总结了各种 不同碳源的利用率。由于价格因素，甜菜糖浆、干酪乳清、植物油、玉米和木薯水解液、 纤维素和半纤维素都是很好的可利用碳源。AI. Eutrophus 菌使用植物油做基质、Az. Vitwlandii 菌使用木薯水解液做基质等过程都已经被开发出来。 PHA 生产 目前，ZENECA 生物制品公司是唯一一家商业化生产 PHA 的企业，它采用 AL eutrophus 菌 间歇投料法，每年能生产 P(3HB-co-3HV)1000 吨。其他也能在很多地方看到培养别的种类 细菌生产 PHA 的方法。产碱杆菌 Alcaligenes eutrophus 经常被应用到生产 P(3HB) 和 P(3HB- co-3HV)，产量最高分别可以达到 2.42 和 2.55 gl /Hl-1。丙酸是被用来生产 P(3HB-co-3HV)碳 基质的组成部分，它的价格比葡萄糖贵两倍，因此 P(3HB-co-3HV)的价格自然比用葡萄糖生 产的 P(3HB)贵。以乙酸、丙酸、乳酸和丁酸为碳源，对 AL
