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1、第一章第一章 项目背景及立论依据项目背景及立论依据1.11.1 本项目研究的必要性本项目研究的必要性早在三千年前，中国的农民已开始淡水鱼塘养鱼；两千年前，又开始在沿海养殖软体水产。数个世纪以来，水产养殖（鱼类、贝类及水生植物）大部分作为一种小规模自给行为而存在，产量较低。但在过去的几十年内，水产养殖业突飞猛进，目前已成为全球增长最快的食物生产体系。专家认为，三十年后，水产养殖将成为人类最大的鱼类及甲壳类消费资源。水产养殖于二十世纪七十年代急速增长，主要有两个原因。首先，由于人口数量开始飞速增长，专家们担心数亿人口将深受食物匮乏之苦。因此，世界银行等国际机构开始鼓励发展中国家的水产养殖，从而解决
2、贫困人口食物营养并促进贫困地区的经济发展。其次，在同一时期，中国开始了经济改革，大力鼓励水产养殖。 可以说，现代化水产养殖是生逢其时。在二十世纪的最后二十几年，世界人口数量从 40 亿激增至 60 亿。人口增长主要是在发展中国家。同时，野生鱼类的捕捞无法跟上不断增长的消费需求。根据联合国粮农组织（ Food and Agriculture Organization，FAO) 二十世纪国际渔业及水产养殖报告 （The State of World Fisheries and Aquaculture 2000），二十世纪七十至八十年代，野生鱼类捕捞量踌躇不前，进入九十年代后没有增长。预计全球野生鱼
3、类捕捞在未来几年内甚至可能会下降。 FAO 指出，全球主要海产品资源中约有四分之三已达最大产出潜力。 国际市场对鱼类及其它形式的动物蛋白的需求不断增长。位于华盛顿特区的国际粮食政策研究院（该研究院隶属于一全球性农业研究网络）的一位高级研究人员克里斯多夫 -德尔加多（Christopher Delgado）说，“直到现在，发展中国家人口饮食结构还是以淀粉为主，但这些国家的人们已开始寻求其它饮食资源”。全球有数百万人以鱼类为主食。FAO 统计数据显示，2002 年非洲地区动物性蛋白质的摄取量 19是来自鱼类，中国是 21、亚洲是23。依国家层次来看，鱼类占营养需求的比例更高，就菲律宾而言，53的动
4、物性蛋白质来源是来自于摄取鱼类。Subasinghe 指出，发展中国家人民经常以鱼类尤其是价格低廉的淡水鱼类的主要原因，是因该鱼类是贫困民众所消费得起的鱼类。除家计经济考虑外， “吃鱼”有更多好处。鱼类富含蛋白质及多种维生素和矿物质，如维生素 A、维生素 D、磷、镁、硒及碘等等，即使是一小块鱼，亦绝对有益健康。此外，多种鱼油也被证实有益身体健康。来自联合国粮食与农业组织的报告称：世界上消费的鱼类接近一半为养殖鱼，而不是野生捕捞。2006 年世界水产研讨会报告显示：1980 年左右，人类消费的鱼类产品仅有 9%来自养殖，而今天上升到43%。发展中国家养殖业除可直接打击饥饿外，亦可间接减缓贫穷，提
5、供就业及提高外汇收入。今日，鱼类是国际上最被广为交易的食品之一，2001 年世界水产品总产值为 560 亿美元，其中开发中国家所占比例超过 50。而到 2006 年消费的养殖鱼总量为 4550 万吨，价值约 630 亿美元。水产养殖是通过现代化技术促进鱼的生长，而不是通过大量增加池塘数量来实现水产养殖业的迅猛增长的。不久前，亚洲养殖业开始使用粒化饲料喂养淡水有鳍鱼。此类饲料的主要成份是农副产品，包含大豆及少量鱼肉。这些现代化饲料根据养殖鱼类进行配方，可提供最适量的脂肪、蛋白质、碳氢化合物、纤维素及维他命。在这些现代化饲料的辅助下，亚洲养殖业的产量增长了 10 倍。现在，通过采用新的技术，使鱼类
6、个体重量增加，满足我国激增的市场需求。1.21.2 鱼类消化酶和鱼类生长关系的研究现状鱼类消化酶和鱼类生长关系的研究现状鱼类消化酶的活力和鱼类的生长密切相关，据Lemieux 等（2003）报道在大西洋鳕，Dimer 等（2004）报道在鲑鱼和神仙鱼中均可通过提高消化酶活力以改善饲料转化效率和生长速率。迄今为止，在欧洲鳟鱼、塞内加尔比目鱼、日本 鲽、红鼓鱼、斑点尾鲈、大西洋红鲈 等海产鱼以及黄颡鱼、鳜鱼、鲤鱼等淡水鱼中都有类似成功的报道。近年来，在人工饲养的条件下，如何提高鱼类消化酶的活力一直是水产养殖研究热点。早期研究主要集中在分析和鉴定各个鱼种的消化酶的特性，根据各种鱼消化酶的特性配制合适
7、的人工饲料，为鱼体内消化酶提供良好的环境，使鱼体内的消化酶活力处于最佳的状态，以提高鱼体对营养的消化和吸收。研究表明，消化酶活力与鱼龄相关，随发育阶段的不同而不断变化，因此可依据特定养殖鱼类在不同生长阶段的消化酶特性变化，设计出相应的配合饲料以有效、快速地提高其生长及养殖效益。但是，不同鱼种，不同的生长阶段，消化酶的活力是不同的，同时，消化酶的活力还受到食物的类型的变化，丰富程度的改变而发生变化，因此，准确地判断某一特定时刻鱼体内消化酶的表达情况还非常的困难。所以如何快速而有效的判断鱼体消化酶活力是人工配制饲料方法中急需解决的一个问题。1.31.3 项目发展及可行性研究项目发展及可行性研究肝胰
8、脏是鱼体的主要消化酶分泌器官，而胰蛋白酶是肝胰脏分泌的一种重要的消化酶，因此胰蛋白酶可以作为分析鱼体消化酶总活力的重要指标。此外研究还表明，胰蛋白酶是成鱼唯一和食物营养的转化率和吸收率直接相关的消化酶，因此其活力高低在调控鱼体的生长速率过程中亦具有重要作用。胰蛋白酶的多转录本现象首先在 1993 年于大西洋鳕中被发现，随后在鲑鱼和比目鱼中也发现有胰蛋白酶的多种转录本表达。而且不同鱼种的转录本的核酸及蛋白质序列不同，即转录本具有种属差异性。多转录本的存在被认为是因为不同的转录本在鱼体内行使不同的功能。在鳟鱼中已发现，具有某一特定胰蛋白酶转录本的幼体比没有此转录本的幼体要提早一年长成成鱼，推测这种
9、转录本可能和幼鱼的生长密切相关；在大西洋鲑鱼中也发现了一种新的胰蛋白酶转录本，其存在可以提高胰蛋白酶的消化能力：在相同条件下生长一年，具有此种转录本的个体要比普通鱼的重量增加15%。此外，在比目鱼和鲈鱼等养殖鱼类中也陆续发现有新的胰蛋白酶转录本的表达，但其功能还有待于进一步确认。 综合以上研究报道，我们认为有可能通过增加胰蛋白酶的持续表达以提高养殖鱼类的生长速率，而寻找胰蛋白酶的新转录本无疑是提高其表达的一个很好的切入口。1.41.4 本项目研究工作的概况本项目研究工作的概况我们已就彭泽鲫的胰蛋白酶活力和鱼体生长做了初步研究，在之前的多次实验，结果显示不同个体的胰蛋白酶活力相差比较大，即不同的
10、与个体中 胰蛋白酶的活力存在有个体差异；同时部分鱼体的生长和其胰蛋白酶活力呈正比关系。因此，我们 认为寻找的胰蛋白酶新转录本可以 解释这一酶活力的个体差异性 ，同时，结果显示，因为鱼体因为胰蛋白酶活力的不足，导致鱼体生长的速率下降，进而使鱼的生长时间延长，提高了鱼类养殖的成本。因此，我们下一步的工作将在彭泽鲫中寻找转录本，以证实我们的推断。第二章第二章 技术方案分析技术方案分析2.12.1 项目创新点以及技术水平分析项目创新点以及技术水平分析2.1.1 本项目拟定分离和鉴定的基因具有重要的理论意义我们已就彭泽鲫的胰蛋白酶活力和鱼体生长做了初步研究，结果显示不同个体的胰蛋白酶活力相差比较大，即胰
11、蛋白酶的活力存在有个体差异；同时部分鱼体的生长和其胰蛋白酶活力呈正比关系。因此，我们计划寻找的胰蛋白酶新转录本对于解释这一酶活力的个体差异性以及提高鱼体胰蛋白酶的表达具有重要的理论意义。2.1.2 本项目的顺利实施对提高彭泽鲫的养殖效率有重要的经济意义根据已经报导的文献资料，在某些鱼类中，具有特定胰蛋白酶转录本表达的个体比没有此转录本的鱼生长数率要高15-25%左右。例如 Torrissen 在 1991 报道，大西洋鲑鱼中有特定胰蛋白酶转录本表达的个体要比对照组的重 30%。本项目拟在彭泽鲫中寻找胰蛋白酶的转录本，研究具有这类转录本的彭泽鲫的食物利用率及生长速率是否要比没有此转录本的个体更高
12、，并进一步探讨以分子遗传学技术批量培育具有此转录本的鱼种的可能性，这对提高彭泽鲫的养殖效率显然具有重要意义。2.1.3 本项目的实施对填补我省在胰蛋白酶研究方面的空白具有重要的意义国外对于养殖鱼类消化酶的研究主要集中在胰蛋白酶上，但研究的对象大多为鲑鱼、欧洲鲈鱼等国外经济类鱼。国内目前有关消化酶的研究仍主要集中在饲料组成、温度及酸碱性等对于消化酶活力的影响方面。对于我国常见养殖鱼类是否也有胰蛋白酶转录本的表达、以及这类转录本对常规养殖鱼类食物消化及个体生长有何影响等的相关研究，迄今还几乎是空白。我省是养殖大省，因此，增加对鱼类消化酶的研究分析，将更加有利于的促进水产养殖的可持续发展。2.22.
13、2 项目技术方案项目技术方案2.2.1 胰蛋白酶基因 cDNA 的分离和鉴定电子信息杂交筛选。从 GenBank 数据库中得到鱼胰蛋白酶候选基因。用 Clustalw 软件对多个鱼种（如鲑鱼、比目鱼、鲽等）中胰蛋白酶基因编码序列进行同源分析，选取高度保守的编码序列作为信息探针，将其输入美国国家生物信息中心（ NCBI）的局部同源比较服务器筛选鱼类 EST 数据库进行 BLASTN 分析(Alstchul 等，1997)，筛选出长度 100bp，同源度在 75%95%的 EST 作为候选序列，送入 GenBank 核酸数据库检索，排除已克隆基因的 ESTs 后，利用 GCG 中 ASSEMBLY
14、 程序将余下 ESTs 序列进行整和拼接，获得统计上一致的序列，构建 EST 重叠群。2.2.2 候选基因 cDNA 的分离。总 mRNA 提取及总 cDNA 池（ cDNA pool） 的合成。根据 1胰蛋白酶基因在鱼体组织的表达信息，取鱼的肝脏、血、脾、肠道等组织，用 TRIzol (Life Technologies, GIBCO BRL) 总 RNA 抽提试剂盒从上述组织中抽提总 RNA，进而提取总 mRNA 并合并成总 cDNA 池。应用 MarathonTM cDNA Amplification Kit (CLONTECH Inc, 美国) 在 cDNA 两端平端连接含有多个限制性
15、内切酶位点、自身互补的黏性末端接头，试剂盒配有公用的接头引物（ adaptor primer, AP）。阻抑性 RACE 方法。以同源性高的保守序列为依据设计引物 2对目的基因进行搜寻，具体方法是针对所构建的EST 重叠群整合序列，进行计算机同源性比较，选取同源性最高的一段序列，综合考虑引物设计的几项原则，用 PRIMER5.0 软件设计基因特异性引物（gene specific primer, GSP1），与接头引物 AP1 一起经 PCR扩增出相应的 cDNA 并纯化克隆测序。再根据测序结果，设计出相反方向的基因特异性引物 GSP2，进一步获得全长的目的cDNA。PCR 反应条件：94预变
16、性 3 min，然后 94 1 min ，55 min 60 1 min ，72 2 min，共 35 个循环，后接 72 延伸10 min。PCR 产物经琼脂糖凝胶电泳检测。经克隆测序后，用GCG软件 Assemble 进行拼接。完整可读框的证实。在所拼接的含完整可读框的cDNA 序列 35 UTR 和 3UTR 设计一对引物，在彭泽鲫 cDNA 文库中扩增，以证实可读框。2.2.3 计算机软件分析将所获得的 cDNA 序列通过 NCBI 检索查新，并在 GenBank 注册。并用 PC-GENE(IntelliGenetics Inc. Switzerland) 等软件对新基因 cDNA 的核苷酸序列进行结构分析，推导出编码氨基酸序列。用 Clustalw 等软件将推导的氨基酸序列与同源基因编码的氨基酸序列进行同源性比较，找出该序列中存在的保守结构域。2.2.4 分离的转录本的经济性状关联分析和其他鱼类已经公布的胰蛋白酶序列进行比较，分析新得到的转录本和各经济性状的关联。研究的主要经济性状包括：蛋白消化率，鱼的生长速率，鱼
