《高效液相色谱法测定含乳饮料中游离甘氨酸的方法研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《高效液相色谱法测定含乳饮料中游离甘氨酸的方法研究（4页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、高效液相色谱法测定含乳饮料中游离甘氨酸的方法研究宁啸骏? 张燕琴( 国家食品质量监督检验中心(上海) , 上海, 200233)摘? 要? 采用透析法将含乳饮料中游离的甘氨酸提取, 邻苯二甲醛( OPA) 衍生, 其衍生产物经高效液相色谱分离, 于荧光检测器检测。测得含乳饮料中游离甘氨酸的含量, 与样品中蛋白质含量比较, 从而对含乳饮料中是否违规添加甘氨酸进行分析。此方法的回收率为 93?2% 99?4% , 方法精密度(RSD) 为 0?66% 1?01% 。关键词? 含乳饮料, 游离甘氨酸, 高效液相色谱第一作者: 学士, 工程师。 收稿日期: 2006- 09- 05, 改回日期: 20
2、06- 10- 16? ? 甘氨酸( NH2CH2COOH) 又名氨基乙酸, 是氨基酸的一种, 在氨基酸系列中结构最为简单。在食品加工中, 甘氨酸用作食品的防腐剂, 以延长其保质期; 在含酒精饮料和动植物食品的加工中, 则作为调味剂、甜味剂、 增香剂、 营养增补剂。此外, 在甜酱、 酱油、醋、 果汁中添加甘氨酸, 可达到改善食品的风味和增加食品营养的目的 1。2006 年 8 月, 国家质检总局发布预警公告: 部分乳饮料企业为了提高蛋白质含量, 用成本较低的甘氨酸来代替乳粉。在我国, 根据 GB2760?食品添加剂使用卫生标准 2规定, 甘氨酸允许使用的范围仅为调味料和植物蛋白饮料, 且最大使
3、用量是 1?0 g/ kg, 而在含乳饮料中未将甘氨酸作为可以使用的食品添加剂。在美国, 根据 FDA 关于食品添加剂使用范围及限量的有关规定3, 甘氨酸作为特殊膳食和营养添加剂可在所有食品中添加, 但添加后食品中最终的甘氨酸总量( 以游离氨基酸计) 小于等于总蛋白质质量的3?5% 。目前测定氨基酸的主要方法有: 离子交换色谱法、 衍生化高效液相色谱法、 衍生化气相色谱法和衍生化毛细管电泳法、高效阴离子交换色谱- 积分脉冲安培法 4。由于含乳饮料中所添加的甘氨酸是以游离状态存在, 因此判断含乳饮料中是否添加了甘氨酸, 不宜将蛋白质水解后测定甘氨酸的总量。文中采用透析法 5, 将样品中游离的甘氨
4、酸与蛋白质大分子分离, 邻苯二甲醛( OPA) 衍生, 其衍生产物经高效液相色谱分离, 于荧光检测器检测, 测得含乳饮料中游离甘氨酸的含量, 与样品中蛋白质含量的比较, 从而对含乳饮料中是否违规添加甘氨酸进行分析。1? 材料与方法1?1? 主要仪器Agilent 1100 高效液相色谱仪, 在线脱气, 四元梯 度泵, 自动进样器, 柱温箱, 紫外检测器, 荧光检测器。1?2? 主要试剂甘氨酸标准品: Sigma Ultra 公司, 纯度 99%,透析袋: Sigma Ultra 公司, 分子截留量为 5 000 u, 邻 苯二甲醛( OPA) , 巯基乙醇, 硼酸钠, 乙腈, 乙酸铵。1?3?
5、 衍生试剂的配制OPA 衍生试剂: 称取 0?1g OPA 试剂和 0?2g 巯 基乙醇于 100mL 的棕色容量瓶中, 用 0?2% 的硼酸钠水溶液定容至刻度。1?4? 甘氨酸标准溶液的配制甘氨酸标准储备液: 1 g/ L, 称取甘氨酸 100 mg 加水定容至 100 mL。甘氨酸标准溶液: 0, 1, 5, 10, 15, 20 mg/ L, 分别准确吸取甘氨酸标准储备液 0、 0?1, 0?5、 1?0、 1?5、 2?0 mL 加水定容至 100 mL。1?5? 色谱条件色谱 柱: Agilent Eclipse XDBC18 ( 4?6 ! 250mm) 。流动相: 梯度淋洗( 见
6、表 1) , 流速: 1?0 mL/ min, 柱温: 30 , 进样量: 10 ?L。荧光检测器: Ex= 330nm, Em= 460nm。表 1? 梯度淋洗表时间/ min0?02 mol/ L 乙酸铵溶液体积分数( pH= 6?5) / %乙腈体积分数/ %0?0802010?0802012?0406015?0406018?08020 25?08020食品与发酵工业FOOD AND FERMENTATION INDUSTRIES136? ?2006 Vol. 32 No. 11 (Total 227)1?6? 实验方法1?6?1? 样品处理准确称取含乳饮料或植物蛋白饮料 1?0 g 于
7、透析袋中, 将透析袋置于 150 mL 的烧杯内, 并在透析 袋的内侧准确加入 30 mL 的水, 外侧准确加入70 mL的水, 透析 2 h( 每隔 30 min 振荡 1 次) , 取透析袋外侧清液, 经 0?45 ?m 的微孔滤膜过滤后待用。如样 品中游离甘氨酸的含量较高时, 可将透析袋外侧清液用水适当稀释, 使样液的最终浓度在标准曲线的范围之内。1?6?2? 衍生反应 标准曲线: 分别准确吸取甘氨酸标准溶液 0?5mL 于 2 mL 的棕色自动进样瓶中, 临进样前加入0?5mL OPA 衍生试剂, 反应 1min 后, 立即进样。样品衍生: 用移液器准确移取样品滤液 0?5 mL 于
8、2 mL 的棕色自动进样瓶中, 再准确加入 0?5 mLOPA 衍生试剂, 反应 1 min 后, 立即进样。经 HPLC分析, 测定峰面积, 从标准曲线查得测定液中甘氨酸的含量。 1?6?3? 结果计算公式样品中游离甘氨酸的含量按下列公式计算:X = c ! 100! F/ m式中, X 为试样中游离甘氨酸的含量(?g/ g), c 为由工作曲线上查出样液中游离甘氨酸的浓度(mg/L), 100 为透析液总体积(mL), F 为样品稀释倍数,m 为样品的质量( g) 。2? 结果与讨论2?1? 液相分离条件的选择分别选用甲醇?水, 乙腈?水, 乙腈?0?02 mol/ L 乙 酸铵溶液( p
9、H = 6?5) 作为流动相, 进行比较, 发现甲醇 ?水柱压高, 保留时间不稳, 峰形较差; 乙腈?水有明显的拖尾峰, 而采用乙腈?0?02 mol/ L 乙酸铵溶液( pH= 6?5) 的流动相, 峰形好、柱压低、 保留时间稳 定。再通过流动相配比调节和流速调节, 对分析时间、 干扰物质分离情况综合评定, 发现采用 v( 乙腈)#v 0?02 mol/ L 乙酸铵溶液( pH= 6?5) = 2#8, 流速1?0 mL/ min, 标准品( 见图 1) 的保留时间在 6?5 min 左右, 并通过样品空白和样品加标, 确认该条件无干扰峰。图 1? 标准品色谱图? ? 在甘氨酸出峰后选用梯度
10、淋洗的色谱条件, 能去除色谱柱中保留的多余的衍生试剂和样品杂质。 2?2? 检测器条件的选择甘氨酸经 OPA 衍生后可采用紫外检测器? = 330nm 检测, 也可采用荧光检测器 Ex= 330 nm, Em= 465 nm 检测。经实验比较后发现, 以信噪比 3 倍作为最低检出限, 采用紫外检测器? = 330 nm 检测, 样品的最低检出限为 5 ?g/ g, 而采用荧光检测器 Ex= 330 nm, Em = 465 nm 进行检测, 检测最低检出限 1 ? g/ g, 因此, 采用荧光检测器灵敏度更高, 选择性更好。图 2? 7 号样品色谱图2?3? 样品前处理条件的选择甘氨酸的分子质
11、量较小, 且具有很强的水溶性, 采用透析袋的方法能有效地去除大分子的蛋白质, 而将 小分子的游离甘氨酸从试样中提取出来, 起到净化作用。准确吸取 1 g/ L 甘氨酸标准储备液 1 mL 于透析袋中, 按 1?6?1 方法透析, 并每隔 0?5 h 测定透析袋外侧溶液中甘氨酸的含量, 以确定透析所需的时间, 测定 结果见图 3。从图 3 可以看出, 2 h 后透析完全。图 3? 透析时间分析图分析与检测2006 年第 32 卷第 11 期( 总第 227 期)137? ?2?4? 衍生条件的选择甘氨酸本身不能采用紫外检测器或荧光检测器直接进行测定, 且在 C18 柱中没有保留, 无法进行色谱分
12、离。须通过 OPA 衍生后进行测定, 反应式如图 4所示。甘氨酸衍生后的产物见光易分解, 因此在棕色自动进样瓶进行衍生能起到较好的避光作用。此外, 甘氨酸衍生后的产物会随时间的延长逐渐分解, 因此样品必须在每次临进样时才加入衍生试剂。图 4? 甘氨酸衍生反应式2?5? 标准品甘氨酸液相标准曲线按 1?4 中配制的不同浓度的标样溶液进行测定, 绘制浓度- 峰面积标准曲线, 其线性方程为 y =60?673x+ 11?394, 标准品在 0 20 mg/ L 浓度范围 内峰面积与浓度的线性关系良好( R2= 0?999 6) 。 2?6? 加标回收率称取 5 份空白样品, 每份1?0 g。分别加入
13、1 g/ L甘氨酸标准储备液 0?1, 0?5, 1, 1?5 和 2 mL, 按样品 处理方法进行提取、 衍生、 测定样品中甘氨酸的含量,并计算回收率( 结果见表 2) 。从表 2 可以看出, 方法 的加标回收率为( 93?2% 99?4% )表 2? 不同浓度加标回收率样品/?gg- 1添加量/?gg- 1测得量/ ?gg- 1回收率/ % 110093?293?2 150048096 11 00099499?4 11 5001 45396?9 12 0001 89594?82?7? 精密度试验 测定 2 份不同的阳性样品, 按上述方法处理后,衍生、 进样, 分别测定 5 次, 考察其重现
14、性, 结果见表 3。由表 3 可以看出, 5 次实验结果的重现性较好( RSD= 0?66% 1?01% ) 表 3? 精密度实验次数12345RSD( n= 5) / %17207407257367341?01 21 3141 3251 3081 3171 3330?662?8? 样品的测定与分析分别取 12 份不同的含乳饮料, 按上述样品处理方法进行处理后, 衍生、 进样, 测定不同样品中甘氨酸的含量。同时按照 GB/ T 5009?5- 20036的方法测 定每份样品中蛋白质的含量, 对两者的含量进行比较( 见表 4) 。表 4? 样品测试分析表样品号码游离甘氨酸含量/?gg- 1蛋白质
15、含量/ ?gg- 1比值/ %17311?05! 1046?9628?33?78! 1040?023 11?02! 1040 41?51?10! 1040?0151?71?08! 1040?0262?31?12! 1040?02713201?21! 10410?918 11?05! 10409 11?82! 1040101?31?02! 1040?01112?52?30! 1040?01121?41?01! 1040?01? ? 结果表明, 1 号、 7 号( 色谱图见图 2) 游离甘氨酸含量与蛋 白质含量的比值, 均大于 FDA 规定的3?5% 的标准, 可以判定为阳性样品, 2 6 号以及
16、 812 号的游离甘氨酸与蛋白质含量的比值很低, 仅为 0 0?02%, 可能是使用的原料牛乳或乳粉中带入了少量的游离甘氨酸。3? 结? 论利用HPLC 柱前衍生法能准确地测定含乳饮料中游离甘氨酸的含量, 且灵敏度高, 配合含乳饮料中蛋白质总量的测定, 并对两者的比值进行分析, 能准 确地判断含乳饮料中是否违规添加了甘氨酸作为食品添加剂。参考文献1? 宋彦梅, 尹秋响, 王静康 ? 甘氨酸的应用及生产技术 J? 氨基酸与生物资源, 2003, 25(2): 55 60 2? 中华人民共和国国家标准 GB2760- 1996 食品添加剂使 用卫生标准(1999 年增补品种) S 3? 丁汉东? 主要贸易国家和地区食品添加剂法规标准汇编 M? 广州: 广东科技出版社, 2006?286 287 4? 丁永胜, 牟世芬? 氨基酸的分析方法及其应用进展J? 色 谱, 2004, 22(5) : 210 15 5? 王? 立? 色谱分析样品处理 M? 北京: 化学工业出版社,
