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1、 硕士学位论文 柠檬生物活性物质分离纯化及工艺研究 作 者 姓 名 ： 全 晓 艳 学 科 、 专 业 ： 食 品 科 学 学 号 ：212010083201007 指 导 教 师 ： 李 玉 锋 完 成 日 期 ： 2013.04 密级： 柠檬生物活性物质分离纯化及工艺研 究西 华 大学硕士学 位论 文分类号 密级 UDC 密级： Xihua University Master Degree Dissertation The Research of The Purification And Techology of lemon Biologically Active Substances C
2、andidate : Quan Xiaoyan Major : Food science Student ID: 212010083201007 Supervisor: Prof. Li Yufeng April, 2013 Classified Index: UDC: 密级： 西华大学学位论文独创性声明西华大学学位论文独创性声明 作者郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下进行研究工作所取得的成果。尽我所知，除文中已经注明引用内容和致谢的地方外，本论文不包含其他个人或集体已经发表的研究成果，也不包含其他已申请学位或其他用途使用过的成果。与我一同工作的同志对本研究所做的贡献均已在论文中
3、做了明确的说明并表示了谢意。 若有不实之处，本人愿意承担相关法律责任。 学位论文作者签名： 指导教师签名： 日期： 日期 西华大学学位论文版权使用授权书西华大学学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，在校攻读学位期间论文工作的知识产权属于西华大学，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅，西华大学可以将本论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复印手段保存和汇编本学位论文。(保密的论文在解密后遵守此规定) 学位论文作者签名： 指导教师签名： 日期： 日期 西华大学硕士学位论文 I 摘
4、要 柠檬（Citrus limon）中功能成分丰富，近年来随着经济发展，专家学者们越来越关注植物保健品的开发，柠檬具有降血糖、抗菌、抗氧化性等多种生物活性，奠定了其作为未来保健品的备选来源的基础，本论文对柠檬中总皂苷、柠檬苦素化合物、微量元素锌含量进行了测定，并测定了其中超氧化物歧化酶活力，对柠檬多肽进行了初步研究。 本文采用大孔吸附树脂分离、纯化了柠檬中的总皂苷，建立了紫外分光光度法对其含量进行测定。结果表明 10 倍稀释柠檬皂苷提取液中总皂苷含量为 27.1mg/L，20 倍稀释柠檬皂苷提取液中总皂苷含量为 27mg/L，对线性试验考察显示总皂苷以人参皂苷 Re计在质量范围 40200g
5、内线性关系良好 （R2=0.9997） 。 平均加标回收率为 102%、 108.5%和 111%。精密度和重复性表现良好，相对标准偏差分别为 1.82%、1.5%。 采用 80%饱和度硫酸铵提取蛋白质的方法初步提取了柠檬中超氧化物歧化酶， 并通过修改的 Marklund 法对其活力进行了测定，得柠檬粗酶提取液活力为 25.99u/mL，2.0mg/mL 酶标准液活力为 332.42u/mL， 重复性和精密度试验表现性良好， RSD 为 2.15%和 2.16%。 实验探讨了超临界二氧化碳萃取柠檬籽中柠檬苦素化合物工艺，并将最佳工艺条件下提取的样液经高效液相色谱进行了含量测定。柠檬苦素标准品在
6、质量浓度40mg/L-80mg/L 范围内线性关系良好（R2=0.9993），柠檬籽中其含量为 61.03mg/L，样品在 420h 内稳定，重复性和精密度实验 RSD 分别为 1.04%、1.63%。 为了测定柠檬中微量元素锌的含量，样品按程序消解 15min 后，在最佳原子吸收光谱仪工作条件下对其含量进行测定，柠檬汁中锌含量为 1.13g/g。锌浓度在0.05g/mL-0.6g/mL 范围内线型关系良好（R2=0.9993）,加标回收率为 91%、102.25%、105%。对测定不确定度进行了评估，其中对含量结果影响最大的主要是样品重复性测定、锌标准储备液的含量和最小二乘法拟合标准曲线计算
7、含量，相对不确定度分别为0.59%、0.5%、0.274%，而锌标准溶液配制时使用的移液枪和容量瓶和样品消解液定容对测定结果影响较小，采用电子天平称量样品对测定结果的影响可以忽略不计。 采用 Khanan 方法96初步分离柠檬中多肽，并采用超滤离心管截留得到 5KD-30KD的柠檬多肽粗提物。茚三酮显色反应颜色变化为无色变为紫红色变为蓝色。经SDS-PAGE 结果显示在 10kD-15Kd 范围内有条带出现。经反相高效液相色谱洗脱柠檬多肽粗提物与重组人胰岛素标准品，结果显示在几乎相同的保留时间有吸收峰出现。对柠檬样品梯度洗脱条件进行了选择，结果表明梯度洗脱条件较好的是：流动相流速为0.8mL/
8、min，0-1min:A 液为:90%、B 液为 10%；1-30min：A 液为 40% 、B 液为 60%。 柠檬生物活性物质分离纯化及工艺研究 II 关键词：柠檬；总皂苷；超氧化物歧化酶；柠檬苦素；锌；多肽 西华大学硕士学位论文 III Abstract Citrus limon is the most frequently used fruit in food industry, and it has been a focal point for healthcare products research. Functionally, lemon has hypoglycemic, an
9、tibacterial,antioxidant and other bioactivities. In this study, we establish methods for determining the Total saponins, Limonin compounds, The trace element zinc, sod activity ,in lemon, and functionally peptide in lemon was investigated in this paper. In order to determine the total saponins in le
10、mon, the method for separation and purification of total saponins from lemon by macroporous adsorption resin and determination for total saponins by UV spectrophotometry are researched. The total saponins were colored by solution containing vanillin and perchloric acid and then detected by UV spectr
11、ophotometry in 560nm. Ginsenoside Re was taken as control article.The total saponins in 10-flod dilution of lemon sample is 27.1mg/L.The total saponins in 20-flod dilution of lemon sample is 27mg/L. In the 40gg scope, it has a good linear relationship (R2 =0.9997).The average recovery rate are 102%,
12、108.5% and111%, RSD= 2.38%, 1.22%. In order to determine the sod in lemon, the method for separation of SOD from lemon by 80% saturation ammonium sLfate initially and determination for SOD by Marklund are researched.The activity of lemon SOD sample is 25.99u/mL.The standard solution of SOD is 332.42
13、u/mL.RSD=2.15%,2.16%. In order to determine the limonin in lemon, the method for separation of limonin from lemon by SFE and determination for limonin by HPLC are researched. In the 40mg/L 80mg/L scope, it has a good linear relationship (R2 =0.9993). The limonin in lemon sample is 61.03mg/L.The stab
14、ility of lemon sample is 20 h.RSD=1.04%,1.63%. In order to determine Zn in lemon, the method for determination for Zn by microwave digestion and atomic absorption spectrometry are researched.The Zn in lemon juice is 1.13g/g. In the 0.05g/mL 0.6g/mL scope, it has a good linear relationship (R2 =0.999
15、3). The average recovery rate are 91%,102.25% and105%.The Relative uncertainty of determination of sample repeatability and the Zn content of the standard solution and the least squares fit the standard curve content are 0.59%,0.5%,0.274%. The standard solution of Zn in the preparation of pipette and volumetric flask and sample digestion solution constant volume has smaller impact on the determination.The impact of weigh is neglible. In order to research pept
