低剪力上调内皮细胞IL-8 MRNA信号转导途径的实验研究

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1、四川大学博士学位论文英文缩略表英文缩写英文全称中文名称A Sa t h e r o s c l e r o s i s动脉喇样硬化c D N Ac o m p l e m e n tD N A互补D N AC o lc o l l a g e n胶原蚩自D Gd i a c y l - g l y c e r o l甘油二酯D M S Od i m a t h y ls u l f o x i d e_ 二甲基亚矾E c o l ie s c h e r i c h i ac o i l大肠杆菌E C Le r d a a n c ec h e m i l u m i n e s c e n

2、e增强化学发光E C Me x t r a c e l l u l a r m a t r i x细胞外间质E G F Pe n h a n c eg r e e nf l u o r e s c e n tp r o t e i n增强的绿色荧光蛋白E L I S Ae n z y m e l i n k e di m m u n o a d s o r d e n ta s s a y酶联免疫吸附试验E R K l 2e x t r a c e l l u l a rs i g n a lr e g u l a t e d k i n a s e细胞外信号调节激酶E T - 1e n d

3、o t h e l i n 1内皮素一1F A Kf o c a la d h e s i o nk i n a s e粘着斑激酶F A Pf o c a la d h e s i o np l a q u e粘着斑F Nf i b r o n e c t i n纤维粘连蚩白G r b 2g r o w t hr e c e p t o rb o u n dp r o t e i n2生长受体结合蛋自G R Og r o w t hr e g u l a t e do n c o g e n e生K 调：肯癌墓冈H U V E C sh u m a nu m b i l i c a lv e

4、i ne n d o t h e l i a lc e l l s人脐静脉肉皮细胞I L - l Bi n t e r l e u k i n l p白细胞介寨- l pI L gi n t e r l e u k i n - 8白细胞介素8I P 3i n o s i t o lt r i p h o s p h a t e肌醇三磷酸J N Kc J u n N H 2 一t e r m i n a lk i n a s ec - J u n 氨堇末端激酶L N A M EL N G n i t r o a r g i n i n - e m e t h y l e s t e rL 一硝基

5、- 精氮酸甲酯L Nl a m i n i n层粘连蛋白L P S i p o p o l y s a c c h a r i d e脂多糖L S C Ml a s e rs c a n n i n gc o n f o c a lm i c r o s c o p y激光共聚焦显微镜M A P Km i t o g e n a c t i v a t e dp r o t e i nk i n a s e丝裂原活化蛋白激酶英文缩写一览表英文缩写M C P 1N F K BN OO Do P NP A I 1P A XP G I ，P H AP K AP K CP K GR G DR N A

6、iS o sT N F at P AU vV E CV N英文全称m o n o c y t ec h e m o t a c t i cp r o t e i n 1n u c l e a rf a c t o r K Bn i t r i co x i d eo p t i c a ld e n s i t yo s t e o p o n t i np l a s m i n o g e na c t i v a t o ri n h i b i t o r 1p a x i l l i np r o s t a c y c l i np l a n th e m o a g g l u

7、 t i n i nc A M Pd e p e n d e n tp r o t e i nk i n a s ep r o t e i nk i n a s eCc G M Pd e p e n d e n tp r o t e i nk i n a s ea r g i n i n e - g l y c i n e a s p a r a g i c - a c i dR N Ai n t e r f e r e n c es o no f $ e v e n l e s st u m o rn e c r o s i sf a c t o r - c tt i s s u e t y

8、 p ep l a s m i n o g e na c t i v a t o ru l t r a v i o l e tr a yv a s c u l a re n d o t h e l i a lc e l l sV i t r o n e c t i n2中文名称单核细胞趋化蚩白1核转录因fK B一氧化氮光密度骨桥蛋白I 型纤溶酶原激活物抑制因子吻蛋向前列环素植物血凝素蛋白激酶A蛋白激酶C蚩白激酶G精氮酸一甘氨酸大冬氨酸R N A 干扰鸟苷酸释放蚩自肿瘤坏死圉f组织型纤溶酶原激活剂紫外线血管内皮细胞玻璃粘连蛋白四川大学博士学位论文低剪切力上调内皮细胞I L 一8m R N A 信

9、号转导途径的实验研究生物医学工程专业研究生成教摘导师陈槐卿教授要研究背景血液流动对血管产生力的作用，这对于心血管系统稳态的维持有着重要的意义，这些力分为沿血流方向与血管平行的剪切力，垂直于血管壁的压应力和沿血管壁周向的拉应力。此外，它们也在心血管疾病，如动脉粥样硬化等的发生、发展过程中扮演着重要的角色。剪切力，作为血流动力的水平分量，不仅会影响内皮细胞的形态、迁移、分化和增殖，而且还通过调节内皮细胞不同基因的表达在心血管系统的病理和生理过程中起重要作用。在内皮细胞，已发现多种受剪切力调节的基因，根据它们的生物学特性，大致可以分为血管活性物质、生长因子、粘附分子、趋化因子、凝血因子和原癌基因等。

10、我们前期工作表明层流状态的低剪切力( 4 2 0d y n e e r a 2 ) 可诱导培养的人脐静脉内皮细胞I L 8 m R N A 的表达。显然，从最初的剪切力这种物理刺激到最终的I L 8 基因的表达之间必然存在着复杂而精细的信号转导过程。鉴于力学信号的转导过程包括力学耦联( m e c h a n o c o u p l i n g ) ，作用在细胞上的外界应力使胞外基质产生形变。成为能被细胞所感知的局部信号；生化耦联( b i o c h e m i c a lc o u p l i n g ) ，细胞将局部信号转化为细胞内的生物化学信号并最终影响基因的表达或蛋白的活化等过程。我

11、们拟从以下几个方面探讨低剪切力上调内皮细胞I L 8m R N A 的信号转导途径：1 ) 研究整合素在低剪切力上调内皮细胞I L - 8 基因表达中的作用；2 ) 研究细胞骨架在低剪切力上调内皮细胞I L 8 基因表达中的作用；3 ) 研究低剪切力上调内皮细胞I L 8 基因表达过程中胞内信号转中文摘要导途径：4 ) 研究细胞内丝裂原活化蛋白激酶( m i t o g e n a c t i v a t e dp r o t e i nk i n a s e ，M A P K ) 家族各亚类信号转导通路在低剪切力诱导的内皮细胞I L 8 基因表达中的调控作用。由于内皮细胞、白细胞等在某些刺激

12、因素存在的条件下可合成、分泌I L 8 ，那进入循环系统的I L 8 会不会以自分泌或旁分泌的形式影响到内皮细胞的功能是我们关心的另一问题。据此，在本实验的第五部分我们研究了r h I L 8 对内皮细胞增殖、凋亡及分泌功能的影响。研究方法 我们选用培养的人脐静脉内皮细胞( h u m a nu m b i l i c a lv e i ne n d o t h e l i a lc e l l s ，H U V E C s ) 及内皮细胞株E C V 3 0 4 、E A h y 9 2 6 为靶细胞，应用流室系统体外研究了参与低剪切力( 4 2d y n e c m 2 ) 上调内皮细胞I

13、 L 8 m R N A 转录活性的信号转导途径。在具体的研究工作中如下的方法被采用：1 研究整合索在低剪切力上调内皮细胞I L ，8 基因表达中的作用。( 1 )应用流式细胞术检测纤维粘连蛋白( f i b r o n e c t i n ，F N5 0 g m 1 ) 处理对H U V E C s 细胞膜表面整合素。p 3 ，0 t 2 ，p l 表达的影响；( 2 ) 采用定量R T - P C R 检测H U V E C s 经低剪切力刺激后I L 8 基因的表达情况及G R G D N P ( 一种R G D 的类似物，可抑制整合素和含R G D序列的细胞外基质结合) 、抑制性整合素

14、抗体对其的干预作用。2 研究细胞骨架在低剪切力上调内皮细胞I L 8 基因表达中的作用。( 1 ) 采用定量R T - P C R 检测H U V E C s 经低剪切力刺激或给予细胞松弛素D ( c y t o c h a l a s i nD ) 预处理后再行剪切力刺激或仅c y t o e h a l a s i nD 处理后I L 8 基因的表达情况：( 2 ) 利用F a c t i n 特异性荧光染料一p h a l l o i d i n ，观察低剪切力或F a c t i n 细胞骨架破坏剂- - c y t o e h a l a s i nD 对H U V E C s 细胞

15、骨架重排的影响。3 。研究低剪切力上调内皮细胞I L 8 基因表达的胞内信号转导途径。采用定量R T - P C R 检测H U V E C s 经低剪切力( 4 2 0d y n e c m 2 ) 刺激后I L 8 基因的表达情况及多种信号分子阻断剂对其的干预作用。4 探讨M A P K 家族各亚类信号转导通路在低剪切力诱导的内皮细胞I L 一8 基因表达中的调控作用。( 1 ) 采用W e s t e r n b l o t 分析低剪切力4四川大学博士学位论文处理不同时间对H U V E C sE R K l 2 ( e x t r a e e l l u l a rs i g n a

16、lr e g u l a t e dk i n a s e ，E R K l 2 ) 、J N K ( c J u nN H 2 t e r m i n a lk i n a s e ) 、P 3 8 信号分子磷酸化水平的影响，并分析相应的阻断剂对其磷酸化水平的抑制程度；( 2 ) 利用细胞免疫化学的方法观察低剪切力作用前后上述三种信号分子的细胞内定位情况；( 3 ) 通过应用阻断剂或共转染显性负突变D N P 3 8 基因或R N A 干扰技术阻断E R K l 2 、J N K 或P 3 8信号通路，观察阻断对低剪切力诱导的内皮细胞I L 8 基因上调的影响。5 探讨人重组白细胞介紊一8 ( r h I L 8 ) 对内皮细胞增殖、凋亡及分泌功能的影响。运用流式细胞术、比色法、放免法、E L I S A 等技术检测0r i g m l 2 0 0n g m l 的r h l L 一8 ，作用不同时间( 1 2h 4 8h ) 对H U