利用蛋白水解液进行藻青素生物聚合物的微生物合成

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1、Rendered-protein hydrolysates for microbial synthesis of cyanophycin biopolymer 利用蛋白水解液进行藻青素生物聚合物的微生物合成藻青素是一类由细菌胞内产生和储存的多聚（精氨酰 -天冬氨酸 ）生物聚合物。藻青素已被提议作为一种可再生能源来替代石化工业产品。藻青素的生物合成需要一种丰富的氨基酸和氮源如蛋白质水解物。提炼蛋白主要是用来在动物饲养和水产养殖中作为饲料添加剂。新用途将扩大这一类蛋白质产品的市场规模。我们准备和详细描述了肉骨粉水解液， 接着首次证实，这些水解液可用于发酵生产藻青素。利用准备的肉类和骨粉的酶水解液，

2、我们获得粗制的藻青素产品，在摇瓶和 10L 生物反应器发酵研究生产中其含量都是采用相关的酪氨基酸生产33% 35%。在变性条件下，藻青素聚丙烯酰胺凝胶电泳分析显示分离的聚酰胺的分子量为24kDa。该实验结果为利用提炼蛋白副产物生产藻青素生物聚合物提供一个新的途径。前言、藻青素是一种天然的聚酰胺，广泛存在于细菌的蓝藻门 1 ，虽然最近已通过生理或基因组的证据 2 , 3 证实它存在于其他非蓝藻生物体。生物聚合物在微生物细胞内以游离的颗粒存在，因此也常被称为蓝藻颗粒蛋白（CGP） 。 CGP 聚酰胺的骨干是一个线性的聚酰胺链（天门冬氨酸），并有精氨酸（ Arg）分子修饰，通过天冬氨酸的-羧基与精氨

3、酸侧链的 -氨基形成的酰胺键，精氨酸以一对一的方式连接到天冬氨酸重复单元（图1） 。目前的观点认为CGP是微生物氮的储存体。然而，有些证据表明，蓝藻颗粒还发挥其他有利的作用，如在异行胞内对新固定氮的临时存储 4 , 5 和在丝状蓝藻中作为“塞子”调节异形胞和营养细胞间的分子交换 6 , 7 。藻青素作为一种代替石化工业产品的生物可降解物最近已引起科学领域的关注。针对CGP 应用的最大市场是大量的水处理行业，CGP 的多聚（天冬氨酸）主链聚合物能够作为一种环保物取代作为常用软水剂的聚丙烯（丙烯酸） 。CGP 及其相关的聚天冬氨酸主链其他潜在的应用是作为金属离子交换系统 10 ，作为水凝胶材料 1

4、1 ，并作为生物技术的通用资源和重要化学品 12 和 13 保健品平台。 从事与藻青素及其衍生物生 产 和 生物 降 解 相关 的 技 术和 经 济 问题 研 究 的研究 事 业很 多 1,14,15 。CGP （事实上大多数的生物技术生产的工业产品）成功商业化生产的一个很大挑战是符合原料成本效益的管理或利用 1618 。从这方面考虑， 低成本的剩余农产品原材料和副产品，是发展可行性发酵原料或基质的理想物质。针对CGP 的微生物生产，有研究表明除了通常的碳源和氮源 ， 提供一个氨基酸源对于实现产品的高产是至关重要的 1921 。名为蛋白胨的产品， 是一种为了增加氨基酸为目的的培养基添加剂。商用

5、蛋白胨价格昂贵，增加总体原料成本 22 。因此一类氨基酸含量较高的农工副产物对生物技术生产CGP 是有利的。马铃薯加工厂（贸易名字：portamylasse ）的副产物流含有大量的精氨酸，天门冬氨酸，和天冬酰胺，它被证明能支持CGP 合成 17,23 。在本文中，我们描述了利用水解（肉骨粉）作为氨基酸来源 ， 通 过含 有 克 隆藻 青 素 合成 酶 基 因的 重 组 大肠杆 菌 来生 产CGP 19 。肉骨粉是一个从滞销动物组织中提炼出来的产物，如屠宰场副产品和滞存货24 。如果在处理过程中的任何组织来自反刍动物动物，由此产生的产品被称为“反刍动物肉骨粉”且其使用受特殊限制，根据不同的国家而

6、不同 25 , 26 。例如，在欧洲，反刍动物肉骨粉目前不能被用于喂养任何可能本身成为人类的食物的动物。鉴于这些限制，探寻反刍动物肉骨粉的新的出路是必须的 27 。在本研究中，我们展示了成功地利用肉骨粉水解液对藻青素的生产。材料与方法细菌和培养条件构建基因工程大肠杆菌DH1，含有重组质粒： pMa/c5-914:cphA，如先前所介绍19 。 克隆藻青素合成酶基因的质粒来自于Synechocystis sp. PCC6803。LB培养基（ 1%w/v 胰蛋白胨， 0.5%w/v酵母提取物和0.5%氯化钠）被用于大肠杆菌的常规培养和维持。羧苄青霉素（50 g/mL）用于维持培养基中的选择性压力。

7、细胞在37 250rpm的旋转振动器中生长。酪蛋白氨基酸（CA）来自于 MP Biomedicals (Solon, OH)。蛋白胨和蛋白胨原材料实 验 蛋 白 胨 来 自 于 反 刍 动 物 肉 骨 粉 ， 这 主 要 从Darling International 获得（欧文，德克萨斯州） 。 （在本文中，我们将术语肉骨粉水解产物和蛋白胨互换， 因为后者是一个对各种蛋白质水解物常用的商业术语。 ）蛋白胨的详细生产过程在一个单独的文章论述 28 。简单地说，水解作用前，肉骨粉被己烷脱脂萃取。水解作用是在一个带有恒定搅拌装置的恒温反应器中进行的，以保持肉骨粉处于悬浮状态。所有的反应液中包括9.1

8、%（w/w）的肉骨粉。配制碱性水解液（MA16）6L，0.1g Ca(OH)2/g 为基质，在 85，放置 16 小时。通入二氧化碳至 PH 值下降到 9， 反应终止，其次是用硫酸中和 。 50配制 4L 酶水解液（ M ALC FLA) ） 。反应开始时碱性蛋白酶2.4 L（诺维信集团，巴格斯瓦德，丹麦）加到0.4AU/g 基质中；连续监测pH并通过添加 8M 的 NaOH 来维持 pH 值在 8.5。四小时后， pH 值允许下降到 7，加入风味蛋白酶（诺维信集团）在50 LAPU/g 基质中。八个小时后，通过提高反应温度到90保持 10min 使反应终止。任何一种类型的反应后， 剩余固体物

9、质被通过离心分离，接着用孔径0.45m的过滤容器过滤。 剩余的水解液使用 Bu ch B-191 （弗拉维尔，瑞士） 微型喷雾干燥器脱水干燥。骨粉水解液中的氨基酸分析样品水解液一式三份，根据制造商的指示使用Water 公司的 PicoTag工作系统测定。 水解样品过滤， 真空干燥，然后用 AccQ-Fluor reagent按照制造商说明衍生。色谱法按照Wandelen and Cohenmixture 1 描述的步骤进行 29 ，用-氨基丁酸作为内标物。 水解前分离分析半胱氨酸，使用芬利描述的方法 30 去定量氧化半胱氨酸和胱氨酸到半胱氨酸的转化； 这些样品以与其他样品同样的方式进行分析。骨

10、肉粉水解液的摩尔质量分析用 Water 2695分离模块在等度洗脱条件下， 对每个样品使用两个不同大小的排斥柱进行分析。一个Superdex Peptide 10/300 GL柱（通用电气医疗州，新泽西州）是用来分析较低的摩尔质量范围，一个BioSep-SEC-S 3000 柱（飞诺美公司，托伦斯，加利福尼亚州）是用来分析较高的摩尔质量范围。super dex 柱的洗脱溶剂为50mM 的盐酸水； the BioSep 柱的 5mM 盐酸溶液含 10% （v/v） 的乙腈。 Varian (Palo Alto, CA) 380-LC 蒸发光散射探测器是用来定量结果。每一柱用范围广泛的标准物校准。

11、 在校准过程中使用含有抑肽酶，色素，碳酸酶，白蛋白，及缓激肽（西格玛，圣路易斯，钼）的校准试剂盒及包含有甲状腺球蛋白，克球蛋白，卵清蛋白，肌红蛋白，和维生素 B（Bio-Rad 实验室，里士满，加利福尼亚州）的分离试剂盒。为了对低摩尔质量进行校准，需要从巴赫姆美洲（托兰斯，加利福尼亚州）获得的Ser-Gly 二肽和五肽（肽6）作为补充剂。从双柱中得到的数据使用前面所描述的计算法进行结合 27 。灰分分析灰分测定采用ASTM D 2617-96 31 ，其中包括将陶瓷坩埚放在600的马弗炉中过夜焚烧2 克样品。粗制藻青素的生产，分离和凝胶电泳分析依据弗雷等人所描述的实验设计 19 用摇瓶发酵培养

12、法准备粗制CGP。隔夜培养大肠杆菌 pMa/c5-914:cphA（5毫升在 25毫升锥形烧瓶中） ，其在无机盐培养基 （MM ）中生长（30和200转的旋转振动 ） 19,32 ，每升该培养基中含以下成分（克） ：甘油（ 20） ，柠檬酸三钠二水 （3） ， 磷酸二氢钾（5.55） ， K2HPO 4（4.27） ， NaH2PO4?H2O （2.25） ，（NH 4）2SO 4（1） ，NH4Cl（0.10） ，MgCl2?6H2O（1.25） ，CaCl2?2H2O（0.02） ，钙或肉骨粉水解液（510） ，盐酸硫胺（ 0.005） ，和1毫升的微量元素溶液。硫胺盐酸（储备溶液浓度是5

13、0mg/ml，并使用0.45-mm膜过滤器过滤）和微量元素溶液，以及适量的羧苄青霉素维持对转化细胞的选择压力， 这些试剂在培养基高温灭菌， 冷却到室温后分别添加， 培养基用适量的 1N HCl或1N NaOH调节pH至7。微量元素 溶 液 的组 成 有 （mg/ 100ml 0.1N盐 酸 ） ： （ FeSO4?7H2O (2.0), MnSO4?H2O (1289.7),ZnSO4?7H2O (871.4), CoCl2?6H2O (644.4), CuCl2?2H2O (320.8),Na2MoO4?2H2O (270.3), AlCl3?6H2O (147.1),和H3BO3 (51.

14、2)。隔夜培养后接种 1L的无机盐培养基到 2L的锥形瓶中。在30，200250prm条件下进行培养。在 600nm下测定吸光度来检测细胞生长。当细胞生长进入初始阶段时培养温度升高到37， 这通常发生在接种后六小时。在某些情况下，当没有观测到细胞增长时（见“结果和讨论”一节） ，在开始后 68h该温度转变。我们发现，在 30培养下不考虑其生长行为， 实验结论最终得到的细胞量不受影响。在接种后 24小时，向培养基中添加氯化铵（4g）和甘油（ 10ml） ，并持续保温培养24 h。细胞离心收集和冷冻干燥。测定冻干细胞颗粒重量来确定培养基中的细胞量。 干细胞用去离子水以 1ml/ 0.1g细胞的比例

15、制成悬浮液。通过向悬浮液中添加浓盐酸使其酸化，PH值为1，并于室温下搅拌六小时。该混合物离心去除细胞，上清液转移至清洁烧瓶中。细胞颗粒经过再次酸萃取，悬浮在0.1N盐酸（1ml/ 0.1g原始细胞团）搅拌1小时。 离心后，上清液与以前保存的酸性提取物合并。合并后的酸性细胞提取液用 10N氢氧化钠调整 pH为7。通过离心和冻干收集沉淀物。干燥后的沉淀物即为CGP的粗制备。利用Mini PROTEAN 3 细胞仪（ biorad实验室，赫拉克勒斯，加利福尼亚州）进行变性不连续凝胶电泳分析，用准备好的凝胶预制10%聚丙烯酰胺凝胶（ biorad实验室）。粗制 CGP添加到2样品上样缓冲溶液中 33

16、，95加热四分钟，离心去除不溶物质。取一小份上清液点在聚丙烯酰胺凝胶板上，在Tris甘氨酸 SDS缓冲液系统进行电泳 34 。考马斯亮蓝染色法将凝胶中的多肽显色 34 。大型台式发酵生产粗制藻青素台式（ 14L容量）的生物反应器是用来生产和分离粗制CGP，用于比较以 CA 和M ALC FLA 作为基质的产量。过夜生长培养大肠杆菌pMa/c5-914:cphA（5ml在25ml的烧瓶） ，在含有5g/L钙或MALC FLA 的无机盐培养基中，培养基的制备前面已经描述。将整个5ml的培养基接种到 200ml （500毫升锥形瓶）的同样含有 5g/L钙或MALC FLA 的无机盐培养基中。 在30，250prm的保温箱内培养 1824小时。这200毫升培养液作为菌种接种到10L（14 L容量的发酵容器，装有bioflo 3000批次连续生物反应器）同样含有5g/L钙或MALC FLA