《利用木糖发酵高产酒精菌株的诱变育种和驯化研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《利用木糖发酵高产酒精菌株的诱变育种和驯化研究（3页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1利用木糖发酵高产酒精菌株的诱变育种 和驯化研究摘要:本文以热带假丝酵母作为出发菌株,进行了紫外诱变和驯化,利用木糖生产燃料酒精,以获得高产菌株。通过实验得出:紫外诱变时最佳的菌液稀释倍数为10-4,最佳紫外照射时间为 35s,通过三轮的紫外诱变育种进行筛选,获得酒精产量较高的菌株,其中突变株 Y27,酒精产率达到了 6.78%,木糖利用率为 71.1%。对突变株27 进行了驯化,驯化后的菌株,酒精产率提高到 9.6%,木糖利用率达到了90.3%。 关键词:热带假丝酵母;诱变;木糖 在全球环境恶化和能源危机日益严峻的今天,燃料乙醇作为一种可利用的绿色能源正逐渐成为各国能源发展的战略方向。采用传
2、统的以玉米、小麦等粮食为原料的发酵方法对粮食的需求量很大和成本高的缺点逐渐显现出来,己不能满足市场的需要。尤其我国是个人口大国,粮食安全是关系到人民生活和社会稳定的重大问题。所以我国在“十一五”计划中大力提倡用非粮原料生产燃料乙醇1。 我国以农作物秸秆为代表的木质纤维素类生物质资源十分丰富,年产量高达 6亿多吨,大部分未能被有效利用,造成资源严重浪费。木质纤维素的主要成分是纤维素、半纤维素和木质素混合在一起的材料。在植物纤维素中,纤维素、半纤维素占木质纤维素质量的 70%,纤维素和半纤维素必须经过水解分别形成六碳糖和五碳糖后,才能被微生物利用,发酵生产乙醇。天然半纤维素水解产物的 85-90%
3、是木糖。以植物纤维素原料中的木糖发酵生产乙醇,能使木质纤维素原料的乙醇发酵的产量在原有的基础上增加 25%。因此,实现木糖发酵生产乙醇是决定植物纤维资源生产乙醇经济可行的关键因素。 2木糖过去一直被认为不能被微生物发酵成乙醇,Karczewska2第一次提出用木糖发酵乙醇,但这个发现未引起足够重视,直到 1980 年,wang 等人提出木糖可被一些微生物发酵成乙醇。迄今为止已经发现有一百多种微生物能够利用木糖,其中酵母菌的发酵能力是最强的,也利于工业生产应用。本文以中科院微生物所购买的热带假丝酵母为出发菌株,进行了诱变和驯化,该菌显现出良好的改造及应用前景。 1. 材料与方法 1.1 材料 1
4、.1.1 菌种 热带假丝酵母(G.tropicalis)购自中国微生物菌种保藏管理中心 1.1.2 培养基 木糖固体培养基:木糖 20g/l,蛋白胨 20g/l,酵母粉 10g/l,琼脂 20g/l。 木糖液体培养基:木糖 20g/l,蛋白胨 20g/l,酵母粉 10g/l。 酵母木糖发酵培养基:木糖 50g/l,KH2PO42g/l,酵母粉 1g/l,MgPO41g/l。 酵母木糖驯化培养基:木糖 20 g/l-70g/l,蛋白胨 20g/l,酵母粉 10g/l。 1.1.3 试剂和仪器 灭菌器,空气摇床,超净工作台,旋转蒸发器,2100 分光光度计,试管、平皿,三角瓶,比色皿、酵母浸粉,蛋
5、白胨,木糖,琼脂粉,试剂 a(0.32085g 高碘酸钠溶于 100mL 的 1%稀盐酸溶液中),试剂 b(1.11g/L 的鼠李糖溶液), Nash 试剂(现配现用,150g/L 乙酸钠 100mL 溶液中加入 0.2mL 乙酸和 0.2mL乙酰丙酮)等。 1.2 试验方法 1.2.1 乙醇含量测定的标准曲线重铬酸钾比色法3 吸取 1ml 无水乙醇于 100ml 容量瓶中,稀释至刻度,混匀。分别吸取此稀释液30、1、2、3、4、5、6、7ml 于 50 ml 容量瓶中,各加 15.0 ml 重铬酸钾溶液,加水至刻度,混匀。此标准系列相当于试样中含有0.0、1.00、2.00、3.00、4.0
6、0、5.00、6.00、7.00(V/V)的酒精。以空白标准作参比,在波长 600nm,用 1cm 比色皿测定其余各标准的吸光度。用吸光度对酒精浓度作图,绘标准曲线。 1.2.2 木糖含量的测定 将 1mg/ml 的标准木糖母液用去离子水按不同比例稀释成含糖量为0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6,0.7,0.8mg/ml 的标准木糖液。取有刻度试管,加入 1ml 标准糖液+1mlDNS 混匀于沸水浴 5min 后,冷却,用蒸馏水补充至 10ml,于 490nm 处测吸光值。 1.2.3 生长曲线的测定 (1)挑取一环 4下保存的菌落于 200mLYEPD 液体培养基中,在 30和l
7、00r/min 的条件下培养 18-24h 进行活化培养,即得液体种子。 (2)配制 YEPD 液体培养基 3200mL,分装于三角瓶中,每个三角瓶中准确加入100mL。于 115下高压蒸汽灭菌 30min。 (3)将活化好的液体种子接种于每个三角瓶中,接种量为 6%。 (4)将三角瓶在 100r/min 的摇床中 30下培养。每间隔 2h 取一次样,测其600nm 处的吸光值。 由图 3 可知,1 号菌株在 2h 之后进入对数生长期,在 48h 的时候 OD 值达到最大,然后进入平稳期。 1.2.4 紫外诱变方法4 4挑取一环对数期的原菌于 9mL 的蒸馏水中,振荡均匀后吸取 1mL 的菌悬
8、液于9mL 的蒸馏水中,这样依次稀释至 10-7 的浓度,依次吸取 10-110-7 菌浓度的菌悬液 100L 于 50 个装有完全培养基凝固平板中,每个稀释度各 10 个平板,均匀涂布,取两组 10-110-5 稀释度平板作对照,后八组分别于紫外线下诱变20s,30s,35s,40s。将诱变后的平板和对照平板在无光条件下 30培养 2d,观察并查菌落数。经过试验结果得出致死率最佳稀释度和紫外诱变时间。 1.2.5 木糖发酵菌的驯化 为稳定和提高筛选酵母利用木糖发酵酒精的能力,将筛选菌株接入酵母木糖驯化培养基驯化5培养数代,并逐步提高发酵液中的初始木糖含量,根据秸秆水解液中木糖含量,将木糖含量
9、的上限控制在 7%,直至菌体适应木糖含量上限. 将驯化后的菌株接种发酵,测定其酒精浓度、残糖浓度、pH 等参数,研究其发酵性能。 用灭菌后的接种环挑取 2 环酵母菌接种至木糖浓度为 20g/L 的 100mlYEPD液体培养基中,30摇床 90r/min 连续培养 96h,其后以 6%的接种量将菌液接入木糖浓度为 30g/L 的液体培养基中,30摇床 90 r/min 再次连续培养 96h,以此类推直至在木糖浓度为 70g/L 的液体培养基中培养完毕完成菌株的定向驯化。 2. 结果与分析 2.1 紫外线最佳照射剂量的选择 紫外线照射时间对热带假丝酵母致死率的影响见表 1。 紫外线照射对热带假丝
10、酵母有明显的致死效应,致死率随照射剂量增大而增大。由表 2 可以看出,出发菌株对紫外线照射的耐受能力较强,菌浓度分别为 103 ,104,105 时,在 35s 时 的处理条件下,其致死率为 80.06 %85.91%. 为保证有较高的筛选机率,选择 35s 作为紫外线照射剂量。 52.2 紫外线照射后突变株的选择 菌种经过 3 次诱变后从其中挑选菌落直径较大者 38 株,接入斜面,从中选出 8 株产酒精能力明显高于其它突变株,其产酒精能力见表 2。由表 2 可以看出,经过传代试验,只有 Y11、Y27 能稳定产酶且酶活力较高,其中 Y27 产酒精能力最高为 6.78%。 2.3 驯化菌种 为
11、稳定酵母利用木糖的能力,将菌株接入酵母木糖驯化培养基驯化培养数代,并逐步提高发酵液中的初始木糖含量,驯化后菌体逐渐适应了木糖发酵液环境,对代谢过程中的有害物质的抵抗力逐渐增强,木糖的利用率显著提高,酒精产量提高,见表 3。 3. 结论 本试验以购买的热带假丝酵母菌株为诱变出发菌株,经过紫外线诱变及驯化筛选后,得到 1 株稳定的产酒精生产菌株。热带假丝酵母的诱变育种最佳条件为紫外线照射时间 35s ,菌浓度 104,酒精产率由出发菌 3.28% 提高到 6.78%,木糖利用率由 45.3%提高到 71.1%,驯化之后突变株 Y27 的酒精产率提高到 9.6%,木糖利用率达到了 90.3%。但是该
12、菌株酒精产率还达不到工业化生产水平,应继续采用基因工程育种方法提高其产酒精水平,使之能应用于工业生产。 参考文献: 1 KerstinSkoogandBarbelHalin 一 Hagerdal.EnzymeMierob.Teehnol. 1988;10(2):66. 2PREEZ D J C. Process parameters and environmental. facters affecting D - xylose fermentation by yeasts J . EnzymeMicrob Technol, 1994, 16 (8) : 943 - 955. 63沈怡方,白酒生产技术全书(第一版)M北京:中国轻工业出版社,1998,654-655. 4王莘.紫外线的诱变育种.发酵工艺原理实验技术 2004,10. 5Skoog K,et al.Enzyme Microb.Technol.1988,10(2);66-88.
