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1、南京科捷分析仪器有限公司高效液相色谱仪 http:/ 摘要：建立超高效液相色谱仪串联质谱法鉴别十字花科植物中硫代葡 萄糖苷的分析方法。采用 70甲醇水溶液提取白芥种子中的硫代葡萄糖苷，通 过反相 C12 柱分离，电喷雾一离子阱一飞行时间质谱测定。利用硫代葡萄糖苷 二级质谱裂解产生的 mz l95，241，259，275，291 特征离子和伴随产生的 80，162，163，196，242 Da 中性分子丢失规律，共鉴别出 5 种硫代葡萄糖苷。硫代葡萄糖苷(简称硫苷)是广泛存在于十字花科植物中的含硫次级代谢产 物，主要分布于植物的根、茎和叶中。当植物细胞受到破坏(如挤压、虫咬等) 后，硫苷与植物内
2、生的黑芥子酶接触，降解产生异硫氰酸酯、恶唑烷酮和硫氰 酸酯等化合物J，其中异硫氰酸酯具有良好的生物活性，而且对人畜无害。因 此硫苷及其降解产物的研究引起了科学工作者的浓厚兴趣。根据侧链 R 基团的 不同，目前已发现约 l20 种硫苷，其中有多种具有抗癌、抗肿瘤、杀菌和杀虫 活性的异硫氰酸酯，如吴华等比较几种异硫氰酸酯的杀线虫活性，发现烯丙基 和丙烯酰基异硫氰酸酯具有良好的杀线虫活性。大量研究表明甲硫基己基异硫 氰酸酯等具有良好的抗肿瘤活性，是非常具有潜力的抗癌药物。 硫苷的检测方法主要是传统的化学方法和现代的仪器分析手段。化学方法 耗时、误差大、操作繁琐，只能测定硫苷总量。液相色谱法具有很高的
3、分离效 率，但对于硫苷单体鉴别需要对照品，无法满足快速鉴别硫苷的需要。笔者采 用超高效液相色谱一离子阱-飞行时间质谱联用技术，既能高效分离硫苷，又能 准确、快速鉴别硫苷。对于硫苷及降解产物的研究具有重要意义，同时又能够 提高工作效率。 1 实验部分 1.1 主要仪器与试剂 超高效液相色谱仪-离子阱-飞行时间质谱仪： LCMSIT-TOF 型，日本岛 津公司； 数显恒温水浴锅：HH-6 型， 真空干燥箱：VD23 型，德国 81NDER 公司； 电子天平：AUY220 型，日本岛津公司； 超声波清洗器：KS-120E1 型 旋转蒸发仪：R-216 型，瑞士 BUCHl 公司； 台式高速离心机：H
4、-1650 型， 研磨机：All 基本型，德国 IKA 公司； 白芥种子：产地为湖北武汉； 正己烷、氯仿、乙酸铵、甲酸：分析纯 甲醇：色谱纯，美国 Fisher 公司； 实验用水为美国 Pall 公司 Purelab Ultra 超纯水系统制备的超纯水，电阻 率为 18.2 MQcm。 1.2 硫代葡萄糖苷提取 白芥种子在 105干燥 3h，以灭活黑芥子酶保护硫苷。干燥种子经粉碎后， 过 420m 筛。称取粗粉约 50g 于锥形瓶中，依次用正己烷 50mL，氯仿 50mL 各 3 次除脂。残渣经真空干燥，用 300mL 沸腾的 70甲醇水溶液浸泡，超声提取 30min，连续 2 次，合并提取液
5、，静置至室温。提取液经离心分离，将清液真空 下浓缩至原体积的 20。取 lmL 浓缩液经石墨化碳脱色，滤液供超高效液相色 谱-串联质谱分析。南京科捷分析仪器有限公司高效液相色谱仪 http:/ 1.3 流动相配制 用电子天平准确称量乙酸铵 0.385g，置于 1L 量瓶中，加入 lmL 甲酸，用 水溶解定容后，经 0.22m 微膜过滤，超声波脱气后使用。 l.4 液质联用分析条件 (1)UPLC 条件 ODS Cl8 柱(100mmx 2.1mm，3.5m，日本岛津公司)；柱温：30；流动 相 A：5mmolL 乙酸铵1甲酸溶液；流动相 B：甲醇；流动相流速：0.2 mLmin；进样体积：20
6、L；梯度洗脱：03 min,98%A；325min，9820A；2530min，2020A；30 35min，20-98A。 (2)MS 条件 ESl 负离子模式；电压：-3.5kV；雾化气： N2，流量为 1.5 Lmin；干燥 气压力：100kPa；碰撞气：Ar；检测器电压：1.7 kV；Heat Block 温度： 200；CDL 温度：200；一级质谱扫描范围：mz300700；母离子扫描范围： mz 315650；二级质谱扫描范围：mz 50700；离子累积时间：l0ms； CID 碰撞能量：100；碰撞气能量：l00。 2 结果与讨论 2.1 分析条件选择 硫苷在水溶液中是亲水性阴
7、离子化合物，在反相色谱柱中，保留时间短。 优化实验发现，在 ODS c18 柱上采用流动相 A(5mmolL 的乙酸铵+0.1甲酸)和 流动相 B(甲醇)能够很好分离，并且有很好的质谱响应。质谱 Heat Block 和 CDL 温度采用 200，温度过高会造成硫苷裂解，过低则影响离子化和脱溶剂化 效果。为获得比较丰富的二级离子碎片信息，CID 碰撞能量和碰撞气能量均采 用 100。 2.2 分析结果 按照 l.4 分析条件检测白芥种子提取液，获取硫苷提取离子流色谱图及其 一、二级质谱图(见图 1图 ll)。根据裂解机理，并参考文献9 一 l2，共鉴 定出 5 种硫苷，结果见表 1。南京科捷分
8、析仪器有限公司高效液相色谱仪 http:/ 南京科捷分析仪器有限公司高效液相色谱仪 http:/ 2.3 质谱碎片离子裂解机理南京科捷分析仪器有限公司高效液相色谱仪 http:/ 二级质谱特征离子，对于鉴别硫苷具有重要意义。在 MS2 中，母离子先后 失去 S0。(80 Da)和 C6H10O5(162Da)后产生 242Da 中性分子丢失，氢重排后出 现相对应的 R-C(SH)一 NO-离子。另一裂解途径是硫苷上的氢发生重排后，失 去 C6H1105(163Da)和 C6H1205S(196Da)中性碎片。与此同时，二级质谱中还能 观察到 mz l95，241，259，275，291 的特征离子，这些离子是由于硫与相邻 碳原子发生断裂，并伴有氢重排形成的。 硫代葡萄糖苷负离子模式下主要特征二级碎片离子裂解机理见图 12 3 结语 利用高效液相色谱仪一串联质谱技术快速、高效、准确的分离与鉴定十字 花科植物中硫代葡萄糖苷，对硫代葡萄糖苷二级质谱 80，162，163，196，242 Da 中性分子丢失和 mz l95，241，259，275，291 特征离子裂解机理进行了 阐述和总结，能够准确推测硫代葡萄糖苷化学结构，对于十字花科植物的开发 与利用具有重要意义。原文地址：http:/
