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1、荧光光度分析法与药物分析荧光光度分析法与药物分析化材院 化工 3 班 姚依弟 10081224前言前言当紫外光照射到某些物质的时候，这些物质会发射出各种颜色和不同强度的光，而当紫外光停止照射时，这种光线也随之很快地消失，这种光线称为荧光。利用这种能够反映物质特性的荧光对该物质进行定性和定量分析的方法称为荧光分析法。荧光是分子从激发态的最低振动能级回到它原来的基态时发射的光，激发的完成是由于光的吸收。吸收与荧光密切相关，因为吸收必须先于荧光发射。由于碰撞和热的耗散常使一部分吸收能丧失，剩余荧光的能量比吸收的能量小，因此荧光在更长的波长发射。【一一】荧光分光光度法的分析方法荧光分析的灵敏度一般都高
2、过应用最广泛的比色法和分光光度法。比色法及分光光度法的灵敏度通常在千万分之几；而荧光分析法的灵敏度常达亿分之几，甚至有千亿分之几的。荧光分析法的另一优点是选择性高。荧光分析法还有方法快捷，重现性好，取样容易，试样需要少等优点。荧光分析法也有它的不足之处，主要是指它比起其它方法来说应用范围还不够广泛，因为有许多物质本身不会产生荧光。为使荧光分析法的应用更加广泛，发展了各类荧光分析方法，如对不发荧光的物质可通过某类化学反应使其转变为适合测定的荧光物质，对荧光较弱的物质可采取荧光增敏分析法。荧光分析法可分为直接荧光测定法和间接荧光测定法。直接测定法是利用物质自身发射的荧光进行定量测定。但是自身发荧光
3、的药物寥寥无几，所以一般采用间接法测定。1、直接荧光分析法 直接荧光分析法适用于自身能产生荧光的药物。因荧光性质与溶液的EF值有关，故荧光强度的测定需在适宜的EF缓冲溶液中进行。对于成分复杂的生物供试品，为了防止干扰，有时需利用萃取、沉淀、色谱分离等方法除去干扰物，以降低荧光空白本底，提高分析灵敏度。已用于直接荧光分析法的药物有盐酸洛哌丁胺、双水杨酯、左旋溶肉瘤素、叶酸等。本身能发荧光的物质,可用荧光分光光度法直接测定。鲍霞认为可用荧光分光光度法直接测定氧氟沙星胶囊的含量。取氧氟沙星胶囊药粉用醋酸-醋酸钠缓冲溶液配溶液,2h 后,室温,用试剂作空白,在RF-5301 型荧光分光光度(日本岛津)
4、 上,以 427nm 为激发长,500nm 为发射波长测定荧光强度,计算其标示量的百分含量。本法操作简单,快捷,灵敏度高,结果满意。2、间接荧光分析法 本身荧光很弱的物质,常采用氧化还原反应、配位反应等化学反应将其变为能发荧光的物质,用荧光分光光度法间接测定。（1）氧化还原反应 叶酸本身荧光很弱, 用 KMnO4 氧化叶酸,其氧化产物喋呤-6-羧酸能发荧光。刘欣等人认为通过测定叶酸氧化产物喋呤-6-羧酸的荧光强度,可间接测定叶酸的含量。测定时,在日立 850 型荧光分光光度计上,以 289nm 为激发波长,440nm 为发射波长,测定叶酸氧化产物喋呤-6-羧酸的荧光强度,同时做空白实验,间接测
5、定叶酸的含量。此方法较直接荧光分析法测定叶酸的灵敏度提高 12.5 倍。（2）配位反应铋(Tb) 作为荧光探针,能与喹诺酮核形成 m3m 发光配合物。王磊等人用荧光分析法测定诺氟沙星胶囊的含量,加入了 1.6E-4mol/L Tb3 + 溶液和 pH=6.0 的 HOAc/NH4OAc 缓冲溶液,在日立 850 型荧光分光光度计上,ex 330nm ,em 545nm 处测定其相对荧光强度。此方法具有线性范围宽,灵敏度高,简便,快速等特点。3、胶束增敏荧光分析法胶束增敏荧光分析法是在胶束溶液中进行的荧光分析法，胶束溶液对极性较小的弱荧光物质有增溶作用，对荧光物质的荧光发射有增敏增稳作用。因此，
6、对某些不发荧光或荧光很弱的药物无法进行直接荧光分析法测定时，可通过加入某些增溶增敏试剂来增强药物的荧光，提高药物分析的灵敏度，如加入 CT-MAB,SDS,CPB,PVA 等表面活性剂。4、化学引导荧光分析法化学引导荧光分析法是利用化学反应（氧化还原反应、络合反应、光化反应、化学衍生、颜色反应等）改变药物的荧光特性，使药物产生荧光或提高其荧光强度。5、荧光探针分析法以稀土离子、荧光分子等和药物作用的荧光探针技术，大大拓宽了荧光分析法在药物分析中的应用范围，显著提高了荧光分析的灵敏度和选择性。对荧光探针研究已有综述。 凌连生等综述了脱氧核糖核酸（DNA）荧光探针的研究进展。林章碧等综述了以纳米粒
7、子作为荧光探针在生物分析中的应用。王磊等以铽离子作为荧光探针测定了尿样中痕量的环丙氟哌酸。 赵长春等研究了小蘖碱的特殊的荧光性质。王敏等用荧光探针分析法研究了缩氨基硫脲类钯抗癌配合物的初步筛选与作用机理。6、荧光猝灭分析法对有些药物可利用其对某一特定体系的荧光猝灭作用而进行定量测定。庞志功等利用苦参碱和氧化苦参碱对荧光试剂乙酸乙烯酯的定量猝灭作用，建立了测定苦参碱和氧化苦参碱的荧光分析方法。杜黎明等研究了氯苯胺酸与洛美沙星、环丙沙星、诺氟沙星发生的荷移反应，并对这4种药物进行了定量分析。 此外，荧光猝灭法还用于分析羟基苯丙酮酸、甲硝唑等药物的含量。7、几种新型荧光分析技术（1）导数荧光分析法利
8、用导数荧光光谱法进行物质测定的方法称为导数荧光分析。导数荧光分析可以提高光谱精细结构的分辨能力，减小光谱干扰。所以，导数荧光分析的抗干扰能力强，应用于多组分混合物分析可不经分离而直接进行荧光测定。该方法已用于维生素B、氧氟沙星对映体、环丙沙星等药物的定量测定。（2）同步荧光分析法当一些化合物的激发波长和发射波长存在比较大的差距时，应用同步荧光技术能有效降低散射峰的干扰。同时，对激发和发射光谱同步扫描，对描出的图谱进行微分处理，使重叠的峰彼此分离，可得到较可靠的测量结果。同步荧光分析法与导数荧光分析法联用能取得较高的灵敏度，如用同步-导数荧光光谱法测定尿样中的痕量左氧氟沙星和洛美沙星，检出限分别
9、可达0.3,0.35mg/L。【二二】荧光光度分析法在药物分析中的应用荧光分析法在药物分析中主要用于微量或痕量物质的定性和定量测定,尤其是中药有效成分的检测,在这个领域上的探讨也越来越多,近几年也有报道用于测定脂质体的包封率。但是荧光分析的干扰因素较多,测定时对环境因素敏感,对实验条件要求严格,因此荧光分析法在药物分析中的应用不够广泛,远少于紫外-可见分光光度法。因为中药的化学成分复杂,有效成分难以确定,仅单方制剂亦为一多种成分的混合物,因此要求更严格和更先进的分离、分析手段进行鉴别和含量测定。而荧光分析法具有灵敏度高、选择性强、试样量少和方法简便等优点,故荧光分光光度法在中医药上的应用越来越
10、多。有关药物的分析，药典所规定的标准方法大多采用紫外一可见分光光度法。对于成药（如片剂、针剂和口服液）中药物含量的分析，由于含量大，采用紫外一可见分光光度法分析，不失为一种方便、准确的方法。但对于诸如血清、尿液、组织提取液等生物样品中药物及药物代谢产物的分析，由于其含量低，紫外-可见分光光度法往往达不到所需的灵敏度。荧光分析法与之相比，灵敏度具有显著的优势，为这类物质提供了新的灵敏的分析手段。荧光分析在药物中的应用可追溯至 19 世纪 60 年代，常规荧光分析法最早被应用于分析抗疟疾药物奎宁。随着荧光分析法的发展，其应用范围日益扩大，被广泛用于抗菌素药物、止痛药、镇静剂、止血药等的分析，涉及合
11、成药物、生物药物和天然药物。由于自身具有发射荧光特性的物质相对较少，并且受到拉曼峰和散射光等背景的干扰，常规荧光分析法在药物分析中的应用受到限制。1、在中药药代动力学研究中的应用以荧光检测器代替紫外-可见分光光度法检测,大大提高了分析的灵敏度,使分光光度法得到更广泛的应用。赵维中等对芸香甙的药代动力学进行了研究,利用荧光分光光度法测定其不同时间的血药浓度,应用 3P87 药代动力学软件程序对数据进行处理,符合三室模型。胶囊荧光法利用胶囊溶液对荧光物质的溶解、增敏作用而成为测定微量、痕量荧光物质的一种廉价、快速分析方法。庞志功等研究兔血浆中延胡索乙素的药代动力学,血液中存在的延胡索乙素为痕量物质
12、,直接荧光法难以测出,而使用胶囊荧光法则使最低检测限达2.5E-11 g/mL 。汪宝琪等利用胶囊荧光法,在适当条件下对血浆中秦皮甲素、乙素进行定时监测,并使用 2 环状糊精单分子胶囊荧光技术对甘肃道地药材秦艽中龙胆苦甙在兔血中吸收代谢进行 24 h 监测,绘制用药时曲线,效果良好。2、在中药质量控制研究中的应用荧光分光光度法具有灵敏度高、选择性好、方法快捷、试样量少等特点,广泛应用于中药及其制剂中胺类、甾体类、维生素、蛋白质、氨基酸和酶等的分析。对于中药及其制剂中微量、痕量物质的分析也常采用荧光分光光度法,该法尤其适用于生物体液中药物及其代谢产物的分析。总结总结荧光分析法,与其他方法测定同一
13、样品,结果基本一致,而荧光分析法具有灵敏度高、选择性强、试样量少和方法简便等优点,特别适用于微量或痕量物质的定性和定量测定,尤其是对中成药有效成分的定量测定具有较重要的意义。荧光分析法在医药上应用的研究,近几年已取得一定的成效和经验,但还有待我们进一步深入研究,提高药品的检测水平,以适应我国加入WTO后对药品质量的要求。随着药学学科的发展，人们对药物分析的要求也将越来越高，因此必须运用和发展更适当的分析方法来满足药物分析的要求。个人认为今后的发展方向是：探索并提出常规药物荧光分析新方法；与计算机技术紧密结合，研制出自动化程度高、获得和处理信息速度快的荧光分析仪器；发现和合成选择性优良的药物荧光
14、试剂；与其他现代化分析仪器和方法联合使用，以更准确、更灵敏、更专一和更低检测限获得药物及药物与生物大分子相互作用的有关信息参考文献参考文献1荧光分光光度法在医药上的应用.陈艳，陈庆强.广东药学,2002,12(4):63-65.2鲍霞.荧光光度法直接测定氧氟沙星的含量.光谱实验室,2001 ,18 (2) :265267.3刘欣,黄汉国.高锰酸钾氧化-荧光分光光度法测定片剂中叶酸的含量J.分析化学,2000 ,28 (11) :14061409.4王磊,韩本政,桑立红,等.诺氟沙星-铽荧光体系的研究及分析应用J.中国医药工业杂志.2000 ,31 (11) :508509 ,517.5赵维中,
15、王宇翎,刘功传,等.芸香甙的药代动力学研究J.中国药理学通报,1998 ,14 (2) :178-180.6庞志功,汪宝琪,汪丛莹,等.兔血浆中延胡索乙素药代动力学研究J.药物分析杂志,1995 ,15 (3) :13-16.7汪宝琪,庞志功,张汉利.秦皮甲素、乙素在兔体内的药代动力学研究J.沈阳药科大学学报,1998 ,15 (1) :3-7.8陈国珍，黄贤智，郑朱梓等。荧光分析法（第二版） M.北京：科学出版社，1990.9马红燕，张社争，曹岁平等。 胶束增敏荧光光度法测定土霉素的研究J.分析试验室，2002，21(4):43-45.10梁丽华，王静萍，杜黎明。胶束增敏荧光光谱法测定吡哌酸J. 分析科学学报，2003，19（3）：237-239.11甄健存等。中国药学杂志34(3)1999：174.12潘祖亭等。分析化学，26(8)，1998：997.13潘祖亭等。分析试验室，18(1)，1999：83.14孛桂枝等。分析试验室，18(3)，1999：74；分析化学, 28(3)，2000：33O.15中华人民共和国卫生部国家药典委员会中华人民共和国药典二部（北京） ，化学工业出版社.2005:432.16 潘祖亭，刘义庆，刘小玲药物荧光分析法研究进展2000, 46(6):674.680.
