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1、岛津液相色谱仪使用注意事项1.流动相必须用HPLC 级的试剂，使用前过滤除去其中的颗粒性杂质和其他物质(使用0.45um 或更细的膜过滤)。2.流动相过滤后要用超声波脱气，脱气后应该恢复到室温后使用。3.不能用纯乙腈作为流动相，这样会使单向阀粘住而导致泵不进液。4.使用缓冲溶液时，做完样品后应立即用去离子水冲洗管路及柱子一小时，然后用甲醇(或甲醇水溶液 )冲洗 40 分钟以上，以充分洗去离子。对于柱塞杆外部，做完样品后也必须用去离子水冲洗20ml 以上。5.长时间不用仪器，应该将柱子取下用堵头封好保存，注意不能用纯水保存柱子，而应该用有机相 (如甲醇等 )，因为纯水易长霉。6.每次做完样品后应
2、该用溶解样品的溶剂清洗进样器。7.C18 柱绝对不能进蛋白样品，血样、生物样品。8.堵塞导致压力太大，按预柱混合器中的过滤器管路过滤器 单向阀检查并清洗。清洗方法；以异丙醇作溶剂冲洗：放在异丙醇中间用超声波清洗；用10稀硝酸清洗。9.气泡会致使压力不稳，重现性差，所以在使用过程中要尽量避免产生气泡。10.如果进液管内不进液体时，要使用注射器吸液：通常在输液前要进行流动相的清洗。11.要注意柱子的pH 值范围，不得注射强酸强碱的样品，特别是碱性样品。12.更换流动相时应该先将吸滤头部分放入烧杯中边振动边靖洗，然后插入新的流动相 中。更换无互溶性的流动相时要用异丙醇过渡一下。液相色谱柱使用经验谈色
3、谱柱在使用前，最好进行柱的性能测试，并将结果保存起来，作为今后评价柱性能变化的参考。但要注意：柱性能可能由于所使用的样品、流动相、柱温等条件的差异而有所不同；另外，在做柱性能测试时是按照色谱柱出厂报告中的条件进行(出厂测试所使用的条件是最佳条件 )，只有这样，测得的结果才有可比性。1、样品的前处理：a、最好使用流动相溶解样品。b、使用预处理柱除去样品中的强极性或与柱填料产生不可逆吸附的杂质。c、使用 0.45 m 的过滤膜过滤除去微粒杂质。流动相的配制液相色谱是样品组分在柱填料与流动相之间质量交换而达到分离的目的，因此要求流动相具备以下的特点：a、流动相对样品具有一定的溶解能力，保证样品组分不
4、会沉淀在柱中(或长时间保留在柱中)。b、流动相具有一定惰性，与样品不产生化学反应(特殊情况除外)。c、流动相的黏度要尽量小，以便在使用较长的分析柱时能得到好的分离效果；同时降低柱压降，延长液体泵的使用寿命(可运用提高温度的方法降低流动相的黏度)。d、流动相的物化性质要与使用的检测器相适应。如使用UV 检测器，最好使用对紫外吸收较低的溶剂配制。e、流动相沸点不要太低，否则容易产生气泡，导致实验无法进行。f、在流动相配制好后，一定要进行脱气。除去溶解在流动相中的微量气体既有利于检测，还可以防止流动相中的微量氧与样品发生作用。3、流动相流速的选择：因柱效是柱中流动相线性流速的函数，使用不同的流速可得
5、到不同的柱效。 对于一根特定的色谱柱，要追求最佳柱效，最好使用最佳流速。对内径为 4.6mm的色谱柱，流速一般选择1mlmin，对于内径为4.0mm 柱，流速 0.8ml min 为佳。当选用最佳流速时， 分析时间可能延长。 可采用改变流动相的洗涤强度的方法以缩短分析时间(如使用反相柱时，可适当增加甲醇或乙腈的含量)。 注意：a由于甲醇廉价，对于反相柱推荐使用甲醇体系(必须使用乙腈的场合除外)。b对于正相柱推荐使用沸程为30-60的石油醚或提纯后的己烷作流动相，没有提纯的 己烷不得使用。用水最好使用超纯水(电阻率大于18 兆欧 )，去离子水及双蒸水中含有酚类杂质，有可能影响分析结果。c含水流动
6、相最好在临实验前配制，尤其是夏天使用缓冲溶液作为流动相不要过夜。最好加入叠氮化钠，防止细菌生长。d流动相要求使用0.45 m 滤膜过滤，除去微粒杂质。e使用 HPLC 级溶剂配制流动相，使用合适的流动相可延长色谱柱的使用寿命，提高柱性能常见故障的断定及解决方法诊状可能的原因及解决方法(一)保留时间变化1.柱温变化柱恒温，必要时需配置恒温箱 2.等度与梯度间未能充分平衡至少用 10 倍柱体积的流动相平衡柱3.缓冲液容量不够用25mmol/L 的缓冲液 4.柱污染每天冲洗柱5.柱内条件变化稳定进样条件,调节流动相 6.柱快达到寿命采用保护柱 (二)保留时间缩短1.流速增加检查泵 ,重新设定流速2.
7、样品超载降低样品量3.键合相流失流动相 pH 值保持在37.5，检查柱的方向4.流动相组成变化防止流动相蒸发或沉淀5.温度增加柱恒温(三)保留时间延长1.流速下降管路泄漏 ,更换泵密封圈 ,排除泵内气泡2.硅胶柱上活性点变化用流动相改性剂,如加三乙胺 ,或采用碱质钝化柱3.键合相流失同前 (二 )3 4.流动相组成变化同前 (二)4 5.温度降低同前 (二)5 (四) 出现肩峰或分叉1.样品体积过大用流动相配样,总的样品体积小于第一峰的15% 2.样品溶剂过强采用较弱的样品溶剂3.柱塌陷或形成短路通道更换色谱柱 ,采用较弱腐蚀性条件4.柱内烧结不锈钢失效更换烧结不锈钢,加在线过滤器,过滤样品5
8、.进样器损坏更换进样器转子 (五)鬼峰1.进样阀残余峰每次用后用强溶剂清洗阀,改进阀和样品的清洗2.样品中未知物处理样品3.柱未平衡重新平衡柱 ,用流 动相作样品溶剂(尤其是离子对色谱)4.三氟乙酸 (TFA) 氧化 (肽谱 ) 每天新配 ,用抗氧化剂5.水污染 (反相 ) 通过变化平衡时间检查水质量，用HPLC 级的水 (六) 基线噪声1.气泡 (尖锐峰 ) 流动相脱气 ,加柱后背压2.污染 (随机噪声 ) 清洗柱 ,净化样品 ,用 HPLC 级试剂3.检测器灯连续噪声更换氘灯4.电干扰 (偶然噪声 ) 采用稳压电源,检查干扰的来源(如水浴等 ) 5.检测器中有气泡流动相脱气 ,加柱后背压
9、(七)峰拖尾1.柱超载降低样品量 ,增加柱直径采用较高容量的固定相2.峰干扰清洁样品 ,调整流动相3.硅羟基作用加三乙胺 ,用碱质钝化柱，增加缓冲液或盐的浓度，降低流动相pH 值， 钝化样品4.同前 (四)4 同前 (四 )4 5.同前 (四)3 5.同前 (四)3 6.死体积或柱外体积过大连接点降至最低,对所有连接点作合适调整,尽可能采用细内 径的连接管7.柱效下降用较低腐蚀条件,更换柱 ,采用保护柱(八)峰展宽1.进样体积过大同(四 )1 2.在进样阀中造成峰扩展进样前后排出气泡以降低扩散3.数据系统采样速率太慢设定速率应是每峰大于10 点4.检测器时间常数过大设定时间常数为感兴趣第一峰半
10、宽的10% 5.流动相粘度过高增加柱温 ,采用低粘度流动相6.检测池体积过大用小体积池 ,卸下热交换器7.保留时间过长等度洗脱时增加溶剂含量也可用梯度洗脱8.柱外体积过大将连接管径和连接管长度降至最小9.样品过载进小浓度小体积样品液相色谱仪使用操作规程液相色谱仪使用操作规程总流程：超纯水冲洗柱 流动相分离样品 超纯水冲洗柱 纯乙睛保存柱1 电源准备打开稳压器电源开关，须待电压指示至220V 后，才能开启其他有关设备。2 HP1100 高效液相色谱仪的准备试剂：三氟乙酸乙腈 (Fisher 公司产品色谱纯) 超纯水 (Millipore 超纯水 ) 冰乙酸溶液配置：贮液瓶与流动相的准备A 液 0
11、.1%三氟乙酸（三氟乙酸1ml，超纯水999ml）室温保存B 液 60%乙腈（乙腈600ml， 超纯水400ml）室温保存样品液0.01%乙酸（冰乙酸0.01ml，超纯水100ml）室温保存泵头冲洗液：精滤后超纯水或者是1%色谱纯甲醇室温保存注：贮液瓶应用超纯水清洗干净，备用。流动相溶剂用洁净硼砂漏斗精滤除去微小颗粒。操作者必须清楚并注明A、B 贮液瓶盛装为何种溶剂。冲 洗 泵 头 ： 用 注 射 管 于 软 塑 料 管 末 端 抽 吸 至 有 水 流 出 ， 调 节流 速 开 关 控 制 流 速 为 20-30drop/min. 。 流动相管道排气如果管道中气泡较多，可通过弹击管道，排除气泡
12、，并逆时针旋转脱气泵活塞使其松动， 用注射管于流动相出口的塑料管末端抽吸至管道内气泡排除完全。操作时， 我们通常已经打开了脱气机（气泡严重影响分离效果，所以观察管道中液体是否有气泡非常重要。） 开机 进入HP1100 操作系统a.双击WIN-95 操作界面中左下角Instrument 1 online 图标，进入HP1100 工作站软件操作界面。单击工作站操作界面上方Run control 菜单，在下拉菜单中找到Sample Info 子菜单，单击。在Sample Info 信息框内定义操作者、样品前缀及编号、保存路径等参数。在保存路径项下，将可定义子目录分别输入操作者拼音缩写，以方便检索时互
13、不干扰。b.等待工作站操作界面中泵、柱温箱、检测器各指示图标由灰色转变为绿色后，单击泵、检测器各图标可从其各自弹出的菜单中设定流动相各溶剂比例、流速等。（1） 流速通常为1ml/min 。检测波长通常为280，或者254nm。（2） A 液设置为100%，运行15-30 分钟（目的是色谱柱的预平衡），观察基线走势，基线应为直线，通过单击“Balance”键可将基线调至零点。待基线平稳后可进样。（3） 调整A 液为0，B 液为 100%再运行60 分钟（此时乙腈实际浓度为60%）（4） 在 A 液冲洗同时进行进样环的冲洗：用500l 的针样注射器，在load 状态，注入超纯水500 l。 （反复
14、三次，若是20 l 进样环，则加入20l 以上，多余的水可废液管流出。 通常同一样品上样30 次后应冲洗进样环，如果不同样品，最好， 每次上样前均进行冲洗。）（5） 吸取一定量可直接进样的样品溶液（上样液最好用滤器滤过），将进样阀逆时针旋至 Load 档，将进样针从进样孔处水平推入，按进样器活塞将样品溶液注射入进样环后，立即将进样阀顺时针方向旋至Inject 档，与此同时，数据开始自动收集。（6） 此时样品分析已经完成。在HP1100 主操作界面的检测器图标，关闭检测器，然后关闭色谱仪主机检测器开关（目的是延长检测器寿命）。将B 通道调为0，A 通道调为100%，即A 液冲洗色谱柱约10-30
15、min。用A 液续冲洗色谱柱约10-30m（目的是冲出柱内残留的杂质）（7） A 通道换为C 通道（ 100%乙腈）续冲洗色柱约10-30min。 （目的主要为保护柱） 数据记录的终止与保存电脑将自动收集并保存数据，终止运行后，将自动弹出数据框，或者可通过DATA ANAL YSIS 菜单，调出资料。3 图谱处理4 关机1） HP1100 的关闭在 HP1100 的主操作界面上分别单击关闭泵、检测器图标，或通过菜单关闭。然后，单击 HP1100 的主操作界面右上方“X”，退出Instrument 1 online 程序，返回至WIN-95 操作界面。单击左下角“Start ”菜单，单击 “Sh
16、ut down”,等待关机，待出现“Restart ”提示后，按电脑主机电源键， 关闭电脑主机及显示器。将所有使用仪器用布盖好。关闭排气扇、空调与稳压器开关。2） 清洁卫生实验完毕后，打扫仪器室桌面与地面清洁，保持桌面整洁。3） 仪器使用记录记录当天的仪器使用情况于指定记录本上，包括仪器使用起止时间与出现问题的解决方案，并签上操作者的名字. 液相色谱仪使用及维护方法液相色谱仪使用时要非常注意。 使用卡套柱时，两端的卡套应时刻连接在柱芯上。不管您是平衡色谱柱或是清洗，任何 时候都不能将卡套取下来，否则会造成填料的流失。液相色谱柱使用注意： 卡套柱的安装（加预柱）1将卡套架套入柱芯 2将两片夹套片嵌入柱芯的凹槽，使夹套高于柱芯（见下图） 3将已套到柱芯上的卡套架向上推，直至高过夹套片 4将 “子弹头 “预柱放入卡套片内 5将卡套帽和卡套架旋在一起，然后用手拧紧 6然后依同样的顺序连接好柱子的另一端平衡色谱柱反相色谱柱在经过出厂测试后是保存在乙腈/水中的。请一定确保您所使用的流动相和 乙腈 /水互溶。由于
